有谁知道凯氏定氮的具体步骤，注意事项，！！

这个是凯氏定氮的视频，你可以看下。http://v.youku.com/v_show/id_XNzExNDIwMzI=.html

那个视频不太清楚，几乎看不到~方法大家都留下了，主要还是要靠具体操作~

(一) 方法原理

样品与硫酸一同加热消化， 分解有机质， 释放出的NH3 与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。在定氮消化瓶中，用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵，加热又分解NH3 ，用硼酸吸收， 用标定过的盐酸或硫酸滴定， 从而计算出总氮量， 换算为蛋白质量。
(二) 仪器、设备

1. 仪器
分析天平: 感量0.0001克；实验用粉碎机；半微量凯氏蒸馏装置；半微量滴定管， 容积10毫升；硬质凯氏烧瓶: 容积25毫升， 50毫升；锥形瓶: 容积150毫升；电炉: 600瓦。

2. 试剂
(1) 盐酸: 分析纯， 0.02mol/L， 0.05mol/L标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)；
(2) 氢氧化钠: 工业用或化学纯， 40%溶液(W/V)；
(3) 硼酸: 分析纯， 2%溶液(W/V)；
(4) 硼酸混合指示剂: 溴甲酚绿0.1克， 甲基红0.1克分别溶于95%乙醇中，混合后稀至100毫升， 将混合指示剂与2%硼酸溶液按 1:100比例混合， 用稀酸或稀碱调节PH值为4.5， 使呈灰紫色， 此溶液放置时间不宜过长， 需在1个月之内使用；
(5) 加速剂: 五水合硫酸铜(分析纯)10克， 硫酸钾(分析纯)100克在研钵中研磨， 仔细混匀， 过40目筛；
(6) 浓硫酸: 比重1.84， 无氮；双氧水: 分析纯，30%；蔗糖: 分析纯；
(7) 双氧水硫酸混合液(简称混液): 双氧水、硫酸、水的比例为3:2:1， 即在100毫升蒸馏水中，慢慢加入200毫升浓硫酸， 待冷却后， 将其加入300毫升30%双氧水， 混匀， 此混液可一次配制500～1000毫升贮藏于试剂瓶中备用， 夏天Z好放入冰箱或阴凉处贮藏， 室温(20℃)上下时不必冷藏， 贮藏进间不超过1个月 。

(三) 操作步骤

1. 样品的选取和制备 选取有代表性的种子(带壳种子需脱壳)挑拣干净， 按四分法缩减取样， 取样量不得少于20克。将种子放于60～65℃烘箱中干燥8小时以上， 用粉碎机磨碎， 95%通过40目筛， 装入磨口瓶备用。
2. 称样 称取0.1克试样两份(含氮1～7毫克)， 精确至0.0001克， 同时测定试样的水分含量。
3. 消煮1 将试样置开25毫升凯氏瓶中， 加入加速剂粉末。除水稻为1克外， 其它均为2克。然后加3毫升硫酸， 轻轻摇动凯氏瓶， 使试样被硫酸湿润， 将凯氏瓶倾斜置于电炉上加热， 开始小火， 待泡沫停止后加大火力， 保持凯氏瓶中的液体连续沸腾， 沸酸在瓶颈中部冷凝回流。待溶液消煮到无微小的碳粒并呈透明的蓝绿色时， 谷类继续消煮30分钟，豆类继续消煮60分钟。
4. 消煮2 将试样置于50毫升凯氏瓶中， 加入0.5克加速剂和3毫升混液，在凯氏瓶上放一曲颈小漏斗， 倾斜在电炉上加热， 开始小火(用调压器将电压控制在175伏左右)， 保持凯氏瓶中液体呈微沸状态。5分钟后加大火力(将电压控制在200伏左右)。保持凯氏瓶中液体连续沸腾， 消煮总时间， 水稻、高粱为30分钟， 其它均为45分钟。
注: 消煮中列入两种消煮条件， 经与国际谷物化学协会标准法(ICC)比较， t值测验均不显著， 准确度与精密度也基本一致，在具体工作中可根据实际情况取其一种。
5. 蒸馏 消煮液稍冷却后加少量蒸馏水， 轻轻摇匀。移入半微量蒸馏装置的反应室中，用适量蒸馏水冲洗凯氏瓶4～5次。蒸馏时将冷凝管末端插到盛有10毫升硼酸指示剂混合液的锥形瓶中， 向反应室中加入40%氢氧化钠溶液15毫升(如采用消煮2的条件， 加10毫升即可)。然后通气蒸馏， 当馏出液体积约达50毫升时，降下锥形瓶。使冷凝管末端离开液面， 继续蒸馏1～2分钟， 用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶中。
6. 滴定 谷类以0.02mol/L， 豆类以0.05mol/L标准盐酸或硫酸滴定至锥形瓶中的溶液由蓝绿色变成灰紫色为终点。空白用0.1克蔗糖代替样品作空白测定。消耗标准酸溶液的体积不得超过0.3毫升。

(四) 结果计算

式中:
V2 滴定试样时消耗标准酸的体积(毫升)
V1 滴定空白时消耗标准酸的体积(毫升)
N标准酸溶液的浓度(mol/L)
K 氮换算成粗蛋白质的系数
W 试样重量(克)
X 试样水分含量
0.0140每毫摩尔氮的克数
平行测定的结果用算术平均值表示，保留小数后二位。
两份试样粗蛋白质的平行测定结果为15%以下时， 其相对相差不得大于3%；15%～30%进为2%；30%以上为1%。

凯氏定氮法中的常量，微量，和半微量区别：
区别在于检测用样品量，你可以按标准进行操作，没有必要拘泥于某一方法
主要看你样品量是否足够
1、常量由于可以把全部消化液一同蒸馏测定，故较适合蛋白质含量低的样品。
2、微量、半微量差别在装置上，二者皆属于水蒸汽蒸馏操作，只是前者把蒸汽直接导入反应室内，后者把蒸汽导入反应室外加热，由于二者皆取消化液的一部份操作，可平行蒸馏操作，但检测限要较常量法高。
3、纯粹从回收率的角度看，半微量要稍好。

操作学习视频:http://v.youku.com/v_show/id_XNzExNDIwMzI=.html