简述微生物检验用培养基的湿热灭菌方法和注意事项

(一)常压蒸汽灭菌
(1)常压蒸汽灭菌是湿热灭菌的方法之一，在不能密闭的容器里产生蒸汽进行灭菌。在不具备高压蒸汽灭菌的情况下，常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌方法。此外，不宜用高压蒸煮的物质如糖液、牛奶、明胶等，可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法所用的灭菌器有阿诺氏(Aruokd)灭菌器或特制的蒸锅，也可用普通的蒸笼。由于常压蒸汽的温度不超过100℃，压力为常压，大多数微生物的营养细胞能被杀死，但芽胞细菌却不能在短时间内死亡，因此必须采取间歇灭菌或持续灭菌的方法，以杀死芽胞细菌，达到完全灭菌。
1)巴氏消毒法 是用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中的无芽胞病原菌(如牛奶中的结核分枝杆菌或沙门氏菌)，而又不影响其特有风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法，具体的处理温度和时间各有不同，一般在60-85℃下处理15-30min。具体的方
法可分两类，diyi类是较老式的，称为低温维持法，例如在63℃下保持30min可进行牛奶消毒；另一类是较新式的，称为高温快速法，用于牛奶消毒时只要在85℃下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能杀灭引起Q热的病原体--伯氏考克斯氏体(一种立克次氏体)。
2)间歇灭菌法 又称分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是：将待灭菌的培养基在100℃下蒸煮30-60min，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或20-30℃下保温过夜，诱导残留的芽胞萌发，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。例如，培养硫细菌的含硫培养基就应用间歇灭菌法灭菌，因为其中的元素硫经常规的高压灭菌(12l℃)后会发生熔化，而在100℃的温度下则呈结晶状。
3)蒸汽持续灭菌法 微生物制品的土法生产或食用菌菌种制备时常用这种方法。在容量较大的蒸锅中进行。从蒸汽大量产生开始，继续加大火力保持充足蒸汽，待锅内温度达到100℃时，持续加热3-6h，杀死绝大部分芽胞和全部营养体，达到灭菌目的。
以上三种方法通常是在无高压蒸汽灭菌条件的地方(如农村)使用。
(2)灭菌过程中应注意
1)使用间歇法或持续法灭菌时必须在灭菌物里外都达到100℃后开始计算灭菌时间，此时锅顶上应有大量蒸汽冒出。
2)为利于蒸汽穿透灭菌物，锅内或蒸笼上堆放物品不宜过满过挤，应留有空隙。固体曲料大量灭菌时，每袋以1.5-2.0kg为宜，料袋在锅内用蓖子分层隔开，不能堆压在一起。
3)火大水足才能保证蒸汽足，蒸锅里应先把水加足。一次持续灭菌时，如锅内盛水量不能维持到底．应在蒸锅侧面安装加水口，以便在蒸煮过程中添水。添水应用开水，以防骤然降温。
4)间歇法灭菌时应在每次加热后，迅速降温，然后在室温放置24h，再第二次加热。如果降温慢，往往使未杀死的杂菌大量滋长，反面导致灭菌物变质，特别是固体曲料包装过大时，靠近ZX部分更易发生这种情况。
5)从使用效果看，分装试管、三角瓶或其他容器的培养基，因其体积小，透热快以用间歇法为佳。固体曲料，因其包装较大，透热慢，用间歇法容易滋生杂菌变质或者水分蒸发过多，曲料变得不新鲜，影响培养效果，因此使用一次持续灭菌法较好。
(二)高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌法是微生物学研究和教学中应用Z广、效果Z好的湿热灭菌方法。
(1)灭菌原理
高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸汽灭菌器(锅)中进行的。其原理是：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100℃以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121℃(压力为0.1MPa)，时间维持15-30min。也可采用在较低的温度(115℃，即0.075MPa)下维持35min的方法。此法适合于一切微生物学实验室、YL保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物品的灭菌。
在使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌时，蒸汽灭菌器内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压；所以当水蒸汽中含有空气时，压力表所表示的压力是水蒸气压力和部分空气压力的总和，不是水蒸气的实际压力．它所相当的温度与高压灭菌周内的温度是不一致的。这是因为在同一压力下的实际温度，含空气的蒸汽低于饱和蒸汽。