兼并引物(Degenerate Primer)PCR 密码子具有兼并性，如表22-4，单以氨基酸顺序推测编码的DNA序列是不精确的，但可以设计成对兼并引物，扩增所有编码已知顺序的核酸序列。用兼并引物时寡核苷酸中核苷酸序列可以改变，但核苷酸的数量应相同。兼并度越低，产物特异性越强，设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，针对兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的扩增、克隆和序列分析。现已成功地克隆了猪尿酸氧化酶基因、糖尿病相关肽基因和哺乳动物与禽类的嗜肝病毒基因。用脱氧肌苷(deoxyinosine;DI)引物进行PCR，可以代替编码蛋白的多种兼并密码子中的兼并碱基，DI的特异性主要受cDNA浓度影响。 可以到生物帮那里了解。生物帮，创始于2011年，依托互联网，在注重科学性、实用性和权威性的前提下，面向生物研究者、企业和研究机构，提供Z新、lingxian、jing准、GX、全面的生物产品和技术信息。 用diyi套引物扩增15～30个循环，再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增15～30个循环，这样可使待扩增序列得到GX扩增，而次级结构却很少扩增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子滤过器离心，在第二套引物加入前去除diyi引物。此方法已成功地用来分析ZG仓鼠卵巢细胞AS52的分子突变。AS52细胞含有单拷贝的细胞gpt(guanine phos-phribosy transferase)基因，与哺乳动物具有同源性。套式引物PCR减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。对环境样品中微生物检测和单拷贝的基因靶DNA的扩增是非常有效的。 若将套式PCR的内外引物稍加改变，延长外引物长度(至25～30bp)，同进缩短内引物长度(15～17bp)，使外引物先在高温退火温度下做双温循环扩增，然后改换至三温循环，使内引物在外引物扩增的基础上作低温火温度的三温循环直到扩增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入，两种循环一气呵成，等于只做一次PCR，而灵敏度与套式二次PCR无异，在我们Z近推出的PTc 51气流式DNA热循环仪上就可以完成全部程序。 套式一次PCR的成功，使PCR检测的全过程可以在5h内完成，使当天出检验报告成为现实，也使PCR检测走入临床有了现实的基础。 可以参考： IT can help you.Click www.bio1000.com/zt/experiment/rtpcr.html Sign in account. 复合PCR(Multiplex PCR) 用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法称为复合PCR。这一方法Z初是由Chanberlain 等检测人的基因发展而来。Bej等随之发展了对环境样品中不同属细菌相关基因序列同时PCR扩增的检测方法。两种不同的军团菌(legionella)基因，一为特异嗜肺L基因(mip)，另一种为L-5SrRNA基因，通过引物摇摆(staggered)添加进行复合PCR。首先mip引物PCR扩增7个循环，然后加入5SrRNA引物PCR扩增38个循环。加入不同量的LacZ和LacB基因引物进行PCR扩增可以检测大肠杆菌和与人类粪便污染有关的细菌包括E.coli大肠菌、肠源致病沙门氏菌和志贺氏菌。 在复合PCR中，所有引物Ta值应相近。如果两对引物Tq值差异超过±℃10%，会使扩增产物的量明显不同，其中一种扩增产物或目的DNA很难观察到。另外，靶DNA的长度也应相近，差别大时短片的靶DNA会优先扩增，因此，会产生不同产量的扩增产物，为此，须采用DNA摇摆扩增或加入不等量的引物方法进行解决。 反向PCR(Inverse PCR或Reverse PCR) 反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA(见图22-2)。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段;现已制备了酵母人工染色体(YAC)大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。 该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。 利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。 不对称PCR(Asymmetric PCR) 不对称PCR的基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA(ss-DNA)。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物;其Z佳比例一般为1：50～1：100，关键是限制引物的量。限制性引物太多太少，均不利于制备ss-DNA。也可用普通PCR制备靶DNA双链DNA(ds-DNA)，再以ds-DNA为模板，只用其中一种过量引物进行单引物PCR制备ss-DNA。 产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开，而得到纯ss-DNA。 不对称PCR主要为测序制备ss-DNA，尤为用cD-NA经不对称PCR进行DNA序列分析是研究真核DNA外显子的好方法。 标记PCR(LP-PCR)和彩色PCR LP-PCR(Labelled Primers PCR)是利用同位素、荧光素等对PCR引物5’端进行标记，据此检测目的基因的存在与否，与常规PCR相比更为直观，省去了限制性内切酶酶切及分子杂交等繁琐步骤，而且一次可以同时分析多种基因成分，因而特别适合于大量临床标本的基因诊断。目前该方法只对PCR产物进行定性鉴定。 彩色PCR(Color complement assay)直译为“着色互补性检测”，是LP-PCR的一种，彩色PCR意译更为明确：它用荧光染料标记引物的5’端。荧光染料JOE和FAM呈绿色荧光;TAMRA呈红色荧光;COUM呈蓝色荧光。不同荧光标记的引物同时参加反应，扩增后的目的基因会分别带有引物5’端的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可以根据不同荧光的色泽判断目标基因是否存在及扩增基因的类型。通常仅需2种不同颜色的引物，一种作为基因检测引物;另一种作为控制条件的内对照，即可诊断基因缺失、染色体易位或感染某种病毒。检测多种点突变时，可用更多的色彩，如多点突变的遗传病、几种可疑病毒感染、HLA位点分析都可以用彩色PCR同时检测多个位点。
