晧瀚
发布日期：2010-06-23
总的发明构思两项以上发明申请例子:包括产品\方法和应用等.
权利要求书
1、一种对痢疾志贺氏菌12型和大肠杆菌O152的O-抗原特异的核苷酸，其特征在
于它是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长12235个碱基。
2、按照权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌12型和大肠杆菌O152的O-抗原特异的
核苷酸，其特征在于它是由10个基因组成，它们都位于galF基因和gnd基因之间。
3、按照权利要求2所述的对志痢疾贺氏菌12型和大肠杆菌O152的O-抗原特异的核
苷酸，其特征在于所述的基因是：
关于转运和加工的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因，wzy基因或与
wzy有相似功能的基因；
糖基转移酶基因，包括orf5、orf7、orf9、orf10基因；其中所述的基因：
orf5是SEQ ID NO：1中的4626至5663碱基的核苷酸；
wzx是SEQ ID NO：1中的5663至6874碱基的核苷酸；
orf7是SEQ ID NO：1中的6877至7869碱基的核苷酸；
wzy是SEQ ID NO：1中的7882至8955碱基的核苷酸；
orf9是SEQ ID NO：1中的8960至9721碱基的核苷酸；
orf10是SEQ ID NO：1中的9718至10788碱基的核苷酸。
4、按照权利要求1-2所述的对痢疾志贺氏菌12型和大肠杆菌O152的O-抗原特异的
核苷酸，其特征在于它是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf5、orf7、
orf9、orf10基因；或糖合成路径基因中的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
5、按照权利要求4所述的对痢疾志贺氏菌12型和大肠杆菌O152的O-抗原特异的核
苷酸，其特征在于所述的寡核苷酸是：
源于orf5的寡核苷酸对：
SEQ ID NO：1中的4866至4886碱基的核苷酸和5573至5591碱基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的5156至5176碱基的核苷酸和5587至5595碱基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的4641至4660碱基的核苷酸和5302至5320碱基的核苷酸；
源于wzx的寡核苷酸对：
SEQ ID NO：1中的6189至6207碱基的核苷酸和6731至6750碱基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的5713至5733碱基的核苷酸和6724至6741碱基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的6463至6481碱基的核苷酸和6821至6839碱基的核苷酸；
源于orf7的寡核苷酸对：
SEQ ID NO：1中的7024至7041碱基的核苷酸和7779至7800碱基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的6972至6992碱基的核苷酸和7578至7596碱基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的7131至7148碱基的核苷酸和7693至7674碱基的核苷酸；
源于wzy的寡核苷酸对：
SEQ ID NO：1中的7883至7903碱基的核苷酸和8903至8921碱基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的8049至8069碱基的核苷酸和8876至8894碱基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的8197至8214碱基的核苷酸和8197至8214碱基的核苷酸；
源于orf9的寡核苷酸对：
SEQ ID NO：1中的9020至9040碱基的核苷酸和9630至9647碱基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的8982至9000碱基的核苷酸和9443至9462碱基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的9165至9183碱基的核苷酸和9525至9543碱基的核苷酸；
源于orf10的寡核苷酸对：
SEQ ID NO：1中的9752至9770碱基的核苷酸和10567至10586碱基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的9165至9183碱基的核苷酸和9525至9543碱基的核苷酸，
SEQ ID NO：1中的9934至9952碱基的核苷酸和10513至10530碱基的核苷酸。
6、权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌12型和大肠杆菌O152的O-抗原特异的核苷酸
在体外检测表达O-抗原的细菌的应用。
7、按照权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌12型和大肠杆菌O152的O-抗原特异的核
苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、制造
基因芯片或微阵列用于体外检测痢疾志贺氏菌12型或大肠杆菌O152。
8、权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌12型和大肠杆菌O152的O-抗原特异的核苷酸
的分离方法，其特征在于它包括下述步骤：
1)基因组的提取
在LB培养基中37℃过夜培养志贺氏菌，离心收集细胞，用pH值为8.0的Tris-HCl
和EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟后加入溶菌酶裂解细菌，加入蛋白酶K和SDS降解蛋
白质，再加入RNase去除RNA；加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶
异戊醇抽提两次除其中的酶和蛋白，再用等体积的抽提除去残余的酚；用2倍体积乙
醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA后用70％乙醇洗DNA，Z后将DNA重悬于30μlTE中，基因
组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；
2)通过Long PCR扩增痢疾志贺氏菌12型中的O-抗原基因簇
首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物-ATT
GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物
-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long
Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后
94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；Z后，在68
℃继续延伸7分钟，得到PCR产物；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard
PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；
3)O-抗原基因簇文库的构建
用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng
PCR纯化产物，0.9μl 0.1M MnCl2，1μl 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中
进行；酶切10分钟使酶切后的DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2μl 0.1M EDTA
终止反应，合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶
异成醇混合溶液抽提一次，酚∶氯仿∶异戊醇混合体积比例为25∶24∶1；再用等体积的
抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，Z后重悬于
18μl水中；随后在此混合物中加入2.5μl dNTP，其中包含1mMdCTP、1mMdGTP、1mMdTTP
和10mMdATP，1.25μl 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物
补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其Tth DNA聚合酶的缓冲液，
并将体系扩大为80μl，使DNA的3’端加dA尾，此混合物经混合体积比为24∶1的氯仿∶
异戊醇混合液抽提和抽提，然后与pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为
90μl，其中有25单位的T4DNA连接酶和9μl的10倍T4DNA连接酶的缓冲液，Z后用1/10
体积pH＝5.2的3M NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，70％乙醇洗后溶于30μl
水中得到连接产物，用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆
菌DH5α细胞，取2-3μl连接产物与50μl感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad
公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即
在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG
的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落；将得到的白色菌落即白色克隆转
到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切
鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了痢疾志贺氏菌12型的O-抗原基因
簇文库；
4)O-抗原基因簇全序列的获得
从O-抗原基因簇文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有
限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％
的覆盖率，剩余20％的序列再根据已得到的序列设计引物，再从痢疾志贺氏菌12型的基
因组DNA中直接PCR并对PCR产物测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列，用英国剑
桥Medical Research Council分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4
和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到痢疾志贺氏菌12型的O-抗原基因簇的核
苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证：(1)对每个基因组作6个Long PCR
反应，然后混合这些产物以产生文库；(2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；
5)O-抗原基因簇结构的获得
用The National Center for Biotechnology Information的orffinder发现痢疾志贺氏
菌12型O-抗原基因簇的核苷酸序列中的基因，找到10个开放的阅读框，用blast系列
软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再
用英国sangerZX的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序
列间的精确比对，Z后得到痢疾志贺氏菌12型的O-抗原基因簇的结构。
