什么是微生物免培养技术

其通自选育工选育两类单独使用交叉进行 DNA Shuffling技术 编辑 随着PCR技术发展应用1994美stemmer提全新工进化技术——DNA Shuffling（称洗牌技术）该技术能模拟物数百间发进化程并短实验循环定向筛选特定基编码酶蛋白性提高几百倍甚至万倍功能性突变基其基本原理源同功能相同组同源基用DNA核酸酶I进行消化 产随机片段由些片段组文库使互引物模板进行PCR扩增基拷贝片段作另基拷贝引物引起模板转换重组发导入体内选择突变体作新轮体外重组般通2-3循环课获产物幅度提高重组突变体 2自选育 编辑 自界微物未经工诱变或杂交处理情况进行离纯化（见微物离纯化）进行纯培养测定（见微物测定）择优选取微物菌种种简单易行获优良菌种几率般难满足产需要 3工选育 编辑 诱变育种杂交育种两种 诱变育种 诱发基突变手段微物育种技术1927H.J. 马勒发现X射线增加突变率效；1944C.奥尔巴克首发现诱变效应；随陆续发现许物理（紫外线、γ射线、快等）化诱变素化诱变素3种：①诱变剂与或核酸碱基发化变化使DNA复制碱基置换引起变异羟胺亚硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、硝基胍、亚硝基甲基脲等；②诱变剂碱基结构类似物复制参入DNA引起变异5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤2-氨基嘌呤等；③诱变剂DNA减少或增加1～2碱基使碱基突变点全部遗传密码转录翻译发错误导致码组移突变体现吖啶类物质些氮芥衍物（ICR）等诱变育种操作简便突变率高突变谱广仅能提高产量改进质量扩产品品种简化工艺条件1943自界离青霉素产菌效价20单位/毫升经系列诱变育种效价已达40000单位/毫升；金霉素产菌经诱变发酵液积累甲基金霉素；谷氨酸棒杆菌1299经紫外线诱变能产赖氨酸能产缬氨酸增加产品种类；土霉素产菌经诱变选能减少泡沫突变菌株提高发酵罐利用率诱变育种足缺乏定向性 杂交育种 同基型品系或种属间通交配或体细胞融合等手段形杂种或者通转化转导形重组体再些杂种或重组体或代筛选优良菌种通种离具新基组合重组体选由于具杂种优势旺盛、物量、适应性强及某些酶性提高新品系杂交育种式实验菌株殖式同异性杂交、准性重组、原质体融合、转化、转导、杂种质粒转化等；选择亲株、离群体代培养、择优劣杂种遗传析程基本相同杂交般指交配反应菌株进行交配或接合形杂种种适用范围广酒类、面包、YY饲料酵母育种链霉菌青霉菌抗素产量提高曲霉酶性增强等面均已获功 体细胞融合具性反应品系或种属间细胞融合染色体重组先用酶溶解细胞壁再用氯化钙-聚乙二醇处理原质体促使融合获杂种工业微物菌种改良积极作用 转化转导首先应用于细菌现已广泛用于链霉菌酵母菌等随着重组DNA技术发展重组质粒构建转化系统确立已目基转移受体细胞内能产具重要经济价值物性物质（疫苗、酶等）株系 微物与酿造工业、食品工业、物制品工业等关系非密切其菌株优良与否直接关系种工业产品坏甚至影响质量所培育优质、高产微物菌株十必要微物育种目要物合代谢途径朝所希望向加引导或者促使细胞内发基重新组合优化遗传性状使某些代谢产物量积累获所需要高产、优质低耗菌种作途径诱变育种直广泛应用目前内微物育种界主要采用仍规物理及化等诱变外原质体诱变技术已广泛应用于酶制剂、抗素、氨基酸、维素等菌种选育并且取许重应用意义 4诱变育种 编辑 1.1物理诱变 1.1.1紫外照射 紫外线照射用物理诱变诱发微物突变种非用工具DNA RNA 嘌呤嘧啶吸收峰260nm260nm 紫外辐射效致死剂紫外辐射作用已种解释比较确定作用使DNA 形嘧啶二聚体[1]二聚体形阻碍碱基间配所能导致突变甚至死亡[2] 紫外照射诱变操作简单经济实惠般实验室条件都达且现突变几率较高酵母菌株诱变采用种 1.1.2电离辐射 γ- 射线电离物应用广泛电离射线具高能量能产电离作用，直接或间接改变DNA 结构其直接效应氧化脱氧核糖碱基或者脱氧核糖化键糖- 磷酸相连接化键其间接效应能使水或机产自由基些自由基与细胞溶质发化变化导致DNA 缺失损伤[2] 除γ- 射线外电离辐射X- 射线、β- 射线快等电离辐射定局限性操作要求较高且定危险性通用于能使用其诱变剂诱变育种程 1.1.3离注入 离注入20 世纪80 代初兴起项高新技术主要用于金属材料表面改性1986 逐渐用于农作物育种近微物育种逐渐引入该技术[3] 离注入物吸收能量并且引起复杂物理化变化些变化间体各类性自由基些自由基引起其物损伤使细胞染色体突变DNA 链断裂使质粒DNA 造断裂由于离注入射程具控性随着微束技术精确定位技术发展定位诱变能[4] 离注入进行微物诱变育种般实验室条件难达目前应用相较少 1.1.4 激光 激光种光量流称光微粒激光辐射通产光、热、压力电磁场效应综合应用直接或间接影响机体引起细胞染色体畸变效应、酶激或钝化及细胞裂细胞代谢改变光量细胞内含物任何物质旦发作用都能导致物机体细胞遗传特性发变异同种类激光辐射物机体所表现细胞遗传变化同[5] 激光作种育种具操作简单、使用安全等优点近应用于微物育种取少进展 1.1.5 微波 微波辐射属于种低能电磁辐射具较强物效应频率范围300MHz~300GHz物体具热效应非热效应其热效应指能引起物体局部温度升引起理化反应；非热效应指微波作用物体产非温度关联各种理化反应两种效应综合作用物体产系列突变效应[6] ，微波用于领域诱变育种农作物育种、禽兽育种工业微物育种并取定 1.1.6 航育种 航育种称空间诱变育种利用高空气球、返式卫星、飞船等航器作物种、组织、器官或命体搭载宇宙空间利用宇宙空间特殊环境使物基产变异再返面进行选育培育新品种、新材料作物育种新技术空间环境素主要微重力空间辐射及其诱变素交变磁场超真空环境等些素交互作用导致物系统遗传物损伤使物发诸突变、染色体畸变、细胞失、发育异等 航育种较其育种特殊航技术与微物育种技术机结合技术含量高本高体研究者或般研究单位都难实现能与航技术相结合由家完 1.1.7 压室温等离体诱变育种 压低温等离体（Atmospheric and Room Temperature Plasma）简称ARTP指能够气压产温度25-40 °C间、具高性粒（包括处于激发态氦原、氧原、氮原、OH自由基等）浓度等离体射流ARTP技术作种新型物理微物诱变育种领域着广阔应用前景 等离体适剂量性粒作用于微物能够使微物细胞壁/膜结构及通透性改变并引起基损伤菌株现遗传物质损伤微物启SOS修复机制其诱导产DNA聚合酶ⅣV具3ˊ核酸外切酶校功能于DNA链损伤部位即使现配碱基复制仍能继续前进情况允许错配增加存机ARTP遗传物质造损伤性较高；SOS诱导修复本身容错性修复ARTP性损伤能修复程包容于DNA链微物进行复制修复其能带性错配能 ARTP应用于微物突变育种本低、操作便没物理诱变设备（离束注入等）所需离或电加速、真空制冷等附属设备；ARTP遗传物质损伤机制具较高突变率突变性能于真菌、细菌、藻类等都效；ARTP环境污染保证操作者身安全论用何种气体放电其均害气体产[1] 5化诱变 编辑 2.1.1 烷化剂 烷化剂能与或几核酸碱基反应引起DNA 复制碱基配转换发遗传变异用烷化剂甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、乙烯亚胺、硫酸二乙酯等 甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulphonate，EMS) 用烷化剂诱变率高诱导突变株数点突变该物质具强烈致癌性挥发性用5%硫代硫酸钠作终止剂剂 N- 甲基- N'- 硝基- N- 亚硝基胍（NTG) 种超诱变剂应用广泛定毒性操作应该注意碱性条件NTG 形重氮甲烷（CH2N2）引起致死突变主要原效应能CH2N2 DNA 烷化作用引起[2] 硫酸二乙酯（DMS) 用由于毒性太强目前少使用乙烯亚胺产较少难买使用浓度0.0001%~0.1%高度致癌性使用需要使用缓冲液配置 2.1.2 碱基类似物 碱基类似物结构类似碱基掺入DNA 导致DNA 复制产错配mRNA 转录紊乱功能蛋白重组表型改变该类物质毒性相较负诱变率高往往易突变体主要5- 氟尿嘧啶（5- FU) 、5- 溴尿嘧啶（5- BU) 、6- 氯嘌呤等程世清等[25]用5- BU 产色素菌（枝杆菌T17- 2- 39） 细胞进行诱变物量平均提高22.5%. 2．1.3 机化合物 诱变效般危险性较用氯化锂白色结晶使用配0.1%~0.5%溶液或者直接加诱变固体培养基作用间30min～2d亚硝酸易解所现配现用用亚硝酸钠盐酸制取亚硝酸钠配0.01~0.1mol/L 浓度使用加入等浓度等体积盐酸即 2.1.4 其 盐酸羟胺种原剂作用于C 使G- C 变A- T较用，使用浓度0.1%～0.5%作用间60min～2h 外诱变两种或种诱变复合使用或者重复使用同种诱变效更佳顾华等[7]谷氨酸棒杆菌ATCC- 13761 发菌株经DMS NTG 诱变处理获株L- 组氨酸产菌 2、诱变剂 2.1 诱变剂选择 选择诱变剂需要注意诱变剂专性即某诱变剂或诱变处理优先使基组某些部发突变别部即使少发突变诱变剂专性基础十解万尽管关修复途径必定影响关系并简单其各种素包括诱变处理环境条件能影响突变类型 工业遗传家难确预言改良某菌种需要何种类型水平突变产类型尽能突变体适采用几种互补类型诱变处理远紫外疑所诱变剂合适似乎诱导所已知损伤类型采取效、安全预防容易化诱变剂液体试剂比粉末试剂更易进行安全操作另利素产紧密连锁突变丛趋势尽管种效应某些体系能利条件必须认识能某些特异菌系用某些诱变剂能诱变点通测定易检突变体抗药性突变体或原养型复突变体诱变力相容易验证[8] 2.2 诱变剂剂量 随机筛选佳效看诱变剂适剂量用于筛选存群体高比例所需要突变体使测定效价阶段更省力 菌株改良前决定所用诱变剂适剂量并突变性增强技术打基础聪明做通测定同诱变剂处理同菌种突变力用高单位突变本身测定适剂量能种突变检测困难使用容易检标记耐药标记要估计局限性提供些价值资料