一个目的基因在质粒上，如何将其扩增出来并做实时荧光定量PCR？

斯不说话 2014-06-27 荧光定量PCR 浏览 1089 次

我有一个目的基因，是在质粒上，可以直接提取质粒做模板加引物扩增吗，引物设计还有别的要求吗，需要加酶切位点什么的吗？如果能顺利P出该基因，还想相对定量知道该基因的表达情况该怎么做？

精彩问答

a340244226 发布日期：2017-09-23

是这样的，PCR的原理就不阐述了，实时荧光定量PCR的基本原理是，在PCR体系中，加入引物的同时，加入能与目的基因结合的带荧光标记的寡核苷酸，一条完整的寡核苷酸上有荧光淬灭基团，它能吸收荧光信号。 DNA聚合酶要选择具有3'到5'外切酶活性的酶，这样在PCR扩增过程中，从引物方向过来的DNA聚合酶会把寡核苷酸一个个切掉，在切掉之后，淬灭基团被破坏，荧光信号散发出来被仪器接收，每复制一条DNA就产生一个荧光信号，荧光信号累积就能与PCR产物同步，这样就是跟踪PCR产物。
楼主提取质粒以后需要经过一次琼脂糖凝胶电泳定量，然后对质粒进行稀释，稀释到适当浓度，不然无法确定需要加多少DNA模版在才能满足反应体系的要求，引物设计没有别的要求，只要能完整扩出楼主想要的基因就行。定量的话，根据机器收到的荧光信号就可以定量了。

以上仅个人愚见。

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走巴走巴发布日期：2014-06-28

引物当然要有酶切位点啦，这个是必要的，还需要有保护碱基还有和目的基因对应的差不多有20个碱基

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