求不连续的密度梯度血浆－Percoll离心法操作步骤

博凌科为生物科技-为你解答：不连续的密度梯度血浆－Percoll离心法1）先制备Percoll储存液：Percoll原液（）:0.9%NaCl的体积比为9：1。2）取一50ml聚乙烯管，无菌采集人外周静脉血，加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min，离心， 室温。3）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet-poor Plasma， PPP）。4）余下的沉降全血加入5ml 6%Dextran (分子量500，000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节Z终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。5）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。6）沉淀的细胞用2~3mlPPP重悬7）在一15ml离心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均为用PPP新 鲜配制)、2~3ml细胞悬液，275gX10min.8）单个核细胞及部分血小板位于血浆与42%Percoll液之间，中性粒细胞位于42%Percoll与51%Percoll之间。血小板可通过 25%Percoll离心5min去除，也可在原密度梯度中加入第三个25%Percoll一起离心去除。9）中性粒细胞层用PPP液冼1次，再用含糖的Krebs-Ringer磷酸缓冲液（KRPD，PH7.23）洗1次。10）用这种方法可得80%中性粒细胞，纯度在95%以上。