蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南三

蛋白质/多肽液相分析中的流动相选择

有机溶剂可将吸附在疏水界面的蛋白质洗脱（图14）。

在梯度洗脱期间，当有机溶剂量达到针对每一蛋白质的特定浓度时，蛋白质就会从疏水界面上解吸，继续顺着柱向下，从而从柱中洗脱。

图14. 当有机改性剂的浓度达到特定值时，蛋白质从疏水界面洗脱。


乙腈。在多肽的反相色谱分离时Z常用的有机溶剂为乙腈。为什么选择乙腈？

• 乙腈易挥发，易从样品中去除。

• 乙腈黏度低，柱压低。

• 乙腈的紫外吸收截止波长较短。

• 乙腈长期用于分离应用。

异丙醇。异丙醇在多肽的色谱分离中具有重要作用。尽管异丙醇黏度大（会增大柱压），很少单独用作有机改性剂，但其在提高一些多肽的回收率方面具有重要作用，尤其是强疏水性蛋白。
在此类情况下，以1%~5%的恒定浓度加入异丙醇，以提高疏水性多肽的回收率或洗脱。

其它有机改性剂。很少使用甲醇或乙醇等有机改性剂，除非在分离强疏水性蛋白时。此外，由于乙醇毒性低，因此还用于蛋白质的大规模纯化。

梯度洗脱。多肽的洗脱几乎都采用梯度洗脱法，采用梯度洗脱法分离时，逐渐增大有机溶剂的相对浓度。
当有机改性剂的浓度升到解吸所需的特定浓度时，蛋白质和多肽就从柱上洗脱。如图15所示，有机改性剂的浓度（梯度）变化速率越慢，这些蛋白亚基的分辨率越高。
在该例中，相较于每分钟0.5%的梯度变化速率，每分钟0.25%的梯度变化显着提高了分辨率。
蛋白质/多肽的保留机制的图1中显示了采用每分钟0.15%的梯度变化速率时几种胰岛素的分离过程。采用每分钟0.05%的梯度变化速率洗脱时，分辨率Z大。

图15. 一般情况下，降低有机溶剂浓度变化速率会提高分辨率。

A.   细胞色素c亚基

B.   色谱图A中间片段的重现。

色谱柱：C4 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

降低梯度变化速率增加分辨率时，所需的分析时间必须尽可能短。
但是，梯度变化速率的调整在优化蛋白质和多肽的分辨率方面非常重要。

有时，降低梯度变化速率时，多肽会表现出特异行为（图16）。
分辨率有时不会按照预期增加，反而会降低，导致出现共洗脱，甚至洗脱顺序也会颠倒。
在图16的示例中，洗脱时间为45分钟时多肽11和12表现出Z佳的分离效果。
当洗脱时间增加至90分钟时，多肽11和12间的分辨率降低；而当洗脱时间增加至160分钟时，出现共洗脱峰。
这种保留行为是多肽表面相互作用的结果，导致这种行为的原因目前尚不清楚。
因此，在进行多肽分离时，尤其是在分离蛋白酶水解物时，观察分辨率随梯度坡度降低的变化很重要。
如果分辨率未增加，反而降低，则必须优化梯度变化速率，以Z大化整体分辨率。

图16. 多肽间分辨率有时随着溶剂浓度变化速率的降低（洗脱时间增加）而降低。
这将导致分辨率降低或共洗脱峰的出现，如人生长激素肽图中多肽11和12例示。
在一些情况下，多肽甚至会逆转洗脱顺序。

样品人生长激素的胰蛋白酶水解物。部分显示了多肽图谱。

色谱柱：C18宽孔柱，4.6 x 150 mm

洗脱液：梯度：0~60%乙腈与水溶性溶剂和0.1%TFA混合液和有机溶剂与0.08%TFA混合液在一定时间内形成梯度洗脱。

蛋白质和多肽的反相色谱分析法需要“离子对试剂”。
在流动相中加入离子对试剂，以实现良好的峰形。
目前认为，在没有离子对试剂的情况下，硅胶表面的金属杂质是导致蛋白质/多肽峰形较差的原因。

三氟乙酸。三氟乙酸（TFA）是Z常用的离子对试剂。将浓度为~0.1%的三氟乙酸加入流动相，会在大多数柱上产生良好的峰形（图17）。
降低TFA的浓度能提高LC-MS的检测灵敏度（见22~25页），但由于硅胶表面存在杂质，可能会导致硅胶柱上的峰形较差。
但采用高纯度硅胶柱时，可加入低浓度TFA（图17A——0.01% TFA）。

图17. TFA浓度对峰形和选择性的影响

洗脱液：加入如图所示的TFA，以20%~32%的乙腈（ACN）梯度洗脱，洗脱时间为15分钟。
样品1.血管紧张素II 2.血管紧张素III3.血管紧张素I

其它离子对试剂。尽管目前为止TFA仍是Z常用的离子对试剂，但蛋白质/多肽分离有时会采用磷酸和七氟丁酸（HFBA）等其它试剂。

如图18所示，一些情况下，磷酸可分离一些TFA无法分离的多肽。通常磷酸盐使用浓度约为20-30 mM，pH为2~2.5。此外，磷酸盐缓冲液对一些蛋白质的分离效果要优于TFA。
尽管同TFA一样，磷酸盐缓冲液使用的pH通常较低，但磷酸盐缓冲液也能适应较高的pH，为选择性和分辨率的改变提供了机会（见17页）。
将磷酸盐作为离子对试剂的主要弊端是：磷酸盐不挥发，很难从肽中去除。

一些时候，七氟丁酸用作组蛋白等碱性蛋白分离的离子对试剂

图18. 使用除TFA以外的离子对试剂可能会产生不同的选择性

条件
色谱柱：C18 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米

洗脱液：
A.4%~40% 乙腈—0.1%TFA体系，pH=2,18分钟梯度洗脱。
B.4%~40% 乙腈—20mM 磷酸体系，pH=2,18分钟梯度洗脱。
样品:

1. 缓激肽

2. 神经降压素

3. 蛙皮素

4. 章鱼唾腺精

pH值对多肽保留行为的影响。不论采用TFA和磷酸，还是其它离子对试剂，用于多肽分离的反相流动相通常适应的pH值较低。
在低pH值条件下，羧酸基团——端羧基，以及天冬氨酸和谷氨酸的侧链会进行质子化，且仅有轻微极性。
将流动相的pH值增加至6~7将会使羧酸基团离子化，减弱多肽的疏水性。这将降低各种多肽的保留值，但尤其影响含天冬氨酸或谷氨酸的多肽（图19）。
与其它多肽相比，含天冬氨酸和谷氨酸的多肽的保留值降低更多，从而改变了选择性。尽管增加多肽分离流动相pH的做法不经常采用，但它可以在一些特定情况下发挥作用。

图19. 流动相的pH值会影响多肽的保留值，尤其是含酸性氨基酸残基（天冬氨酸和谷氨酸）的多肽。

条件
色谱柱：ACE 5 C18-300，4.6 x 250 mm
洗脱液：
A.20%~32% 乙腈—0.1%TFA体系，pH=2,15分钟梯度洗脱。
B.20%~32% 乙腈—10mM NH4OAc体系，pH=7,15分钟梯度洗脱。
样品

1. 血管紧张素II

2. 血管紧张素III

3. 血管紧张素I
   
   
   

流速。流动相的流速对反相GX液相色谱法分离的分辨率影响不大。
如图20所示，流动相流速为0.5、1.0或2.0 ml/min时，胰蛋白酶图谱中多肽的分辨率大致相同。
但梯度体积必须恒定才能维持分辨率一致。
这需要随着流速的增加减少梯度洗脱时间。
体系压力随着流速的增加而增加；体系压力可能会限制可用的流速。
此外，较高的流速还会使检测灵敏度稍有降低，但可能增加大分子蛋白或疏水性蛋白的溶解度。

图20. 流动相的流速对多肽的分辨率影响不大。随着流速的变化，总梯度体积必须保持恒定才能维持分辨率一致。

条件
色谱柱：C18小孔柱，4.6 x 250 mm
洗脱液：10%~50% 乙腈~0.1% TFA 体系，时间、流速如图所示
样品β-乳球蛋白的胰蛋白酶水解物