利用NimbleGen序列捕获技术实现定向RNA-Seq

Z近在Nature Protocols杂志上在线发表的一篇文章1介绍了利用NimbleGen序列捕获技术进行转录组定向测序，用于RNA研究中基因发现和表达定量。

RNAseq技术在基因表达研究中得到了广泛的应用，可对表达基因进行无偏见的采样。相比定量PCR可以对更广泛的基因同步分析，相比芯片方法RNAseq测序结果准确性也更高。然而，真核细胞的表达谱具有转录本数量众多、可变剪切情况复杂，且表达量高低差异大的特点。RNAseq测序结果分散在整个基因组中，不同基因测序深度差异显著，对转录水平偏低的转录本往往测序深度不足，为进行特定基因的可变剪切体拼接及定量研究造成阻碍。

而序列捕获技术通过寡合苷酸探针杂交，富集研究所感兴趣的基因或基因组区段，实现了定向测序。将此技术与RNAseq结合，即对RNAseq的测序文库先进行序列捕获实验富集感兴趣的转录本，再进行测序，实现定向RNAseq或RNA捕获测序（CaptureSeq）。这一方法可以提高目标转录本的测序深度，进行灵敏的基因发现、有效的转录本组装和准确的基因表达定量。

文中介绍的实验步骤主要包括探针设计、捕获测序和数据分析如转录本拼接及定量。实验选用了罗氏NimbleGen探针用于目标捕获。NimbleGen可同时生产2万种探针，可覆盖多达200Mb的基因组中的分散区域或连续的区域，可以应对复杂的真核生物转录组。文章指出，在探针设计时，仅针对目标转录本的部分序列设计探针，通过这些探针即可捕获全长转录本，也可发现转录本中的新外显子。当需对特定剪切方式的转录本进行定向研究时，可在探针设计包括连接两个外显子片段的探针，专门捕获这些异构体。

此外，实验设计了用于质控的探针。质控探针包括：1. 非转录的基因间区的探针，以排除gDNA污染；2. 其他可能造成实验室污染如大肠杆菌等的序列捕获探针，以排除实验室污染；3. 数个质控基因的探针，可用于进行测序前qPCR富集分析，或用于数据分析参数的测试；4. 针对掺入样本的ERCC RNA设计的探针。 ERCC RNA Spike-in standards由92个in vitro转录的转录本组成，表达量跨越一个106的范围，这一些标准品被掺入到Z初的RNA样品中进行捕获测序，用于判断测序量是否充足，以及计算捕获off-target rate。另外，将各转录本获得的测序深度，与ERCC RNA Spike-in standards的测序深度比较，可以推算出样本中各转录本的数量。文章作者指出，这个方法应用于转录水平较低的基因的富集，富集率与基因数量相关，如1000个随机选择的基因预期55倍富集效率。

5微克的总RNA约可生成250ng cDNA文库，可将多个样本的文库混合后根据Roche NimbleGen的实验手册进行捕获实验。混合捕获的实验方案可以对大量样本进行低成本的测序。测序后的分析步骤包括比对、拼接、去除非目标序列、新基因（外显子）发现、定量等。

通过这一实验，可以对样本中特定基因的表达进行研究。该方法既RNASeq相比其他表达谱研究方法的优势，又可以进行有目的性的、多样本的研究。尤其在对于表达水平中低等的转录本研究中，可以更好地拼接全长转录本、发现新基因以及定量分析。

1. Tim R Mercer, Michael B Clark, Joanna Crawford, Marion E Brunck, Daniel J Gerhardt, Ryan J Taft, Lars K Nielsen, Marcel E Dinger, John S Mattick. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nature Protocols. 9, 9891009 (2014) doi:10.1038/nprot.2014.058

仅用于科研，不用于诊断