答:DNA提取的完整步骤 :
1. 取新鲜或冷冻样品的肌肉组织100ul-200ul或95%ALC保存的样品组织0.05g。 2. 将组织尽量剪碎,分别装入1.5ml 的离心管中。
3. 每管中加入450ul的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0; 100mM EDTA, pH8.0)
4. 每管加入10% SDS 50-100ul(70-80不定) (1-2%),再加入2.5-5ul(3ul)蛋白酶K (20mg/ml),
是其终浓度达100ug/ml. 混匀,55℃ 3h至过夜(期间将管子颠倒几次)。 5. 样品中加入150ul NaCl(盐析作用),室温8000rpm离心20min,去沉淀,然后在上清液
中加入等体积(500ul)预冷异丙醇(沉淀DNA),混匀,20℃处理30min,14000rpm离心10min,去上清液。沉淀加70%ALC洗涤离心去ALC,室温挥发ALC5-10min,加TE 500ul,加10ul RNAase (终浓度4mg/ul),即2.5ul。37℃ 30min 或65℃ 15min。
6. 加等体积酸液(提取DNA中的蛋白质)缓慢来回颠倒离心管10min,13000-15000rpm离心
10min。用移液管(大口Tip头)小心取出上层相至另外干净的离心管中,不要触到两相之间的白色蛋白层(可视情况重复操作 次)。 7. 加入等体积酚:氯仿(催取酚)(1:1),轻摇,缓慢颠倒混匀10min 13000-15000rpm 离心
5-10分钟,取上层清液于干净离心管中。
8. 加入等体积氯仿(氯仿:异戊醇(阻止氯仿挥发)=24:1),轻摇,缓慢颠倒混匀
10min,13000-15000rpm离心5-10min。取上清液加入1/10体积2M NaCl和等体积-20℃保存的无水乙醇(或等体积异丙醇)(沉淀DNA),沉淀DNA 10min,13000rpm离心5min,去上清,加入100-150ul70%ALC,离心,小心倒掉ALC(当心DNA沉淀丢失),用70%ALC再洗一次,然后去ALC。45℃烘箱烘干15-30min,用双蒸水沿管壁沿四周冲洗(TE量视DNA沉淀量而定,在80-250ul之间),溶解12-24h,-20℃保存备用。
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