IVIS视角——IVIS系统在植物领域的应用（一）

在往期分享中，我们介绍了IVIS成像系统在动物水平的众多应用，其实IVIS同样可以用于全植物成像。此次我们就分享IVIS在水稻氮代谢研究中的应用。

氮是植物生长发育所必需的养分，但其在土壤中的浓度往往达不到Z佳作物生长浓度。因此，提高作物氮素利用率被认为是农业生物技术的一个主要目标。然而，关于作物氮代谢仍有许多需要了解的地方。

在此，研究人员开发了一个分子传感器系统来监测水稻中氮的状态，该方法发表在《Frontiers in Plant Science》杂志上。研究中首先利用该系统研究了尿囊素的作用，尿囊素分解为尿囊素衍生的代谢物，在低浓度下作为氮源使用。参与尿素代谢的两个基因尿囊素酶(OsALN)和尿素渗透酶1 (OsUPS1)，对氮状态高度敏感，在低氮条件下，OsALN迅速上调，而高氮条件下OsUPS1表达上调。基于上述机制，研究人员培育了含有氮分子传感器系统的[proALN::ALN-LUC2]和[proUPS1::UPS1-LUC2]转基因水稻。这种转基因的表达可以模拟内源性的转录调控，即OsALN和OsUPS1基因对外源N状态的响应。

文中使用两种方法来测定分子氮传感器的能力：

方法一：在长期培养中，转基因水稻植株在高浓度氮源培养基(GM+N)或不含氮源的生长培养基(GM-N)中培养5天，随后使用IVIS活体成像系统进行成像及定量。

结果显示，生长在GM+N培养基中的 proUPS1::UPS1-LUC2 水稻植株表现出更高的荧光素酶活性（图1A）。为了对发光信号进行定量，研究人员测定了5个独立的纯合系（具有单个基因拷贝）。生长在GM+N培养基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株发光信号强于GM-N组20倍，而强于对照组约2,800倍（图1B）。

方法二：在短期培养实验中，转基因水稻植株先在GM-N培养基中培养4天，第5天在加入100nM硫酸铵。结果显示，同长期实验结果一样，生长在后期加 氮培养基中proUPS1::UPS1-LUC2 植株，发光信号更强（图1C）。同样对5株独立的纯合系进行了定量，生长在后期加N培养基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株生物发光信号强于GM-N培养基中约50倍，而强于对照组13,000倍（下图1D）。

图1.在高氮培养条件下，proUPS1::UPS1-LUC2 具有很强的发光信号。

(A)对照组和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM+N或者GM–N培养基 中培养5天；

(B)5个独立的纯合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(A)条件下，发光定量结果；

(C)对照组和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM–N生长5天, 或者在GM–N培养基中生长4天，然后加入100 mM硝酸铵培养1天；

(D)5个独立的纯合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(C)条件下的定量结果，以对照组作为基准进行标准化 。

这些结果说明，proUPS1::UPS1-LUC2 传感器能够通过发光信号水平检测外源氮的情况。

同样在研究中对proALN::ALN-LUC2 植株进行了相同的处理。结果显示，在长时间的培养实验中，GM+N和GM-N培养基生长的proALN::ALN-LUC2 没有明显差异（图2A）。对5株独立的纯品系进行发光信号定量，相比GM+N培养基，GM-N培养基生长的proALN::ALN-LUC2 植株发光信号要高约1.8倍，比对照组高约17倍（图2B）。因此很难鉴定GM+N和GM-N培养基对生长的影响。而在短时间培养实验中，连续生长在GM-N培养基中的proALN::ALN-LUC2，发光信号要强于加高氮培养1天的。

图2.在低氮培养条件下，proALN::ALN-LUC2 植株显示强的生物发光信号。

(A)对照组和proALN::ALN-LUC2 植株，在GM+N or GM–N培养基中培养.；

(B)A组相对定量结果；

(C)对照和proALN::ALN-LUC2 植株在 GM–N中培养5天，或者在GM–N培养基中培养4天，然后加入100 mM 硝酸铵再培养1天 ；

(D)C组相对定量结果；GM–N培养基生长的对照组植株作为基准进行标准化。

此外，在文章中，还利用IVIS活体成像系统，探讨了该传感器对于氮源是否具有选择性及对于氮源的敏感性。结果显示proUPS1::UPS1-LUC2 和proALN::ALN-LUC2 对于氮源无特异性，可以广泛的作为水稻等植株中分子氮的传感器。并且proUPS1: UPS1-LUC2 植株在硝酸铵、硫酸铵或硝酸钾浓度> 1mM即表现出强烈的生物发光信号，而低氮浓度(< 0.01mM)信号减弱。0.1mM硝酸钾proUPS1:: UPS1-LUC2 植株诱导强烈的生物发光信号，而0.1mM硝酸铵和硫酸铵则没有。这表明， proUPS1::UPS1-LUC2 传感器监测高氮状态，低氮状态。proALN::ALNLUC2 在低氮浓度(<0.1 mM)下表现出较强的荧光素酶活性，而在高氮浓度下表现出较弱的活性(> 10mM)。

综上，分子氮传感器的信号反映了分子氮的内部状态。结合IVIS活体成像技术，proALN::ALN-LUC2和proUPS1::UPS1-LUC2 可作为分子传感器在不同研究中监测大米内部氮状态。

文献来源：Dong-Keun Lee, Mark C. F. R. Redillas, Harin Jung, Seowon Choi, Youn Shic Kim and Ju-Kon Kim. A Nitrogen Molecular Sensing System, Comprised of the ALLANTOINASE and UREIDE PERMEASE 1 Genes, Can Be Used to Monitor N Status in Rice. Front. Plant Sci, 18 April 2018.