单抗药物研究，ELISA能做的原来那么多！

单抗药物，

市场辽阔，

仿制药迎来机遇

      2014年7月7日，百时美施贵宝（BMS）的Opdivo(简称O药)在日本被批准上市，用于ZL黑色素瘤。O药成为世界上diyi个上市的靶向PD-1的抗体药。

       单克隆抗体(mAbs)是一类用于人类疾病ZL的药物，在目前生物制剂领域增长非常快速，2018年药物销售额前十的药品中，单抗和融合蛋白类的产品占据了八席。其中，阿达木单抗实现销售额199.36亿美元，连续多年蝉联Z畅销药物。随着进入市场的ZL性单克隆抗体的数量不断增加，生物仿制药的数量也会相应快速增加。

单抗仿制药的关键因素

蛋白质三维(3D)结构

       对于单抗仿制药物，蛋白质三维(3D)结构是这些分子生物功能的关键因素，但是三维结构具有高度的复杂性，因此单克隆抗体生物仿制药的研制极具挑战性，单克隆抗体仿制药与它所基于的原研药物之间即使存在微小的结构差异，也会对分子的安全性，有效性和功能产生重大影响。

       单克隆抗体的三维结构除了受到翻译后修饰的影响外，还受到一级、二级、三级和四级结构的共同作用，这种构象被称为蛋白质高级结构(HOS)，这种构像不仅受潜在基因的影响，还会受到包括生产生物仿制药时的细胞系选择、温度、pH、光照等生物工艺条件以及配方方法等因素的影响。

默克黑科技——PCA ELISA

       默克现在推出了检测单克隆抗体复杂高级结构的抗体阵列技术，我们称为PCA(Protein Conformational Array technology) ELISA，依托ELISA技术，通过对重叠区域的肽免疫原产生多克隆抗体(polyclonal, pAbs)，覆盖整个mAb结构，现在已经可以证明，不同的市售单克隆抗体虽然具有几乎相同的氨基酸序列，但却具有不同的高级结构特征。

       当抗体结构发生化学修饰或物理变化时,可使用多克隆抗体组合检测到不同单抗类型中明显的差异每pAb都识别线性结构或二级结构表位，mAb以其正确折叠的本机形式出现时，这些表位可能无法部分或完全暴露，由于这些表位在mAb表面展开或折叠错误的变化，导致信号的变化。这个就是PCA技术的核心原理。

图1：抗体阵列中分布着34种抗体。PCA技术通过pAb阵列覆盖了整个mAb的氨基酸序列

PCA ELISA 试剂盒产品

对于这项技术，

我们有哪些产品提供呢？

       PCA (Protein Conformational Array) ELISAs针对多种已经上市的ZL型单克隆抗体开发的试剂盒产品，下方表格中用于部分已经上市的热门单抗药物高级结构检测的试剂盒，在这些单抗药物中，韩国仿制药公司Celltrion，已经于2016年使用RemiBridge试剂盒向FDA提交英夫利昔单抗类似药物CT-P134申请，并且成功获批：

表1：用于部分已经上市的热门单抗药物高级结构检测的试剂盒展示

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       我们也同时提供通用型单抗蛋白高级结构检测试剂盒，可以检测更多种类的单克隆抗体高级结构比较候选生物仿制药单抗与原研药物的高级结构：InnoBridg，大多数获得许可用于ZL的单克隆抗体属于IgG1亚型，它具有与免疫系统体液和细胞成分相互作用的能力，许多这些产品的序列比对表明，它们共享几个相对保守的序列区域，即使在抗体的可变区域内，依据这个特点，InnoBridge PCA ELISA试剂盒含有多个pAbs，覆盖IgG1不同保守序列区域 这使得研究人员能够快速简便地检测一种新的单克隆抗体的保守序列，InnoBridge的另一个用途是作为一种质量控制的工具，确保在mAb的生产过程中蛋白高级结构(HOS)不变，在生产过程的每个阶段，研究人员都可以采用InnoBridge作为质量控制措施，以评估蛋白高级结构(HOS)的变化。

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实际应用中是怎样的？

举个“栗子”

“栗1”

       Rituxan（利妥昔单抗）：利用PCA ELISAs分析过程开发中的蛋白高级结构（HOS）

       在建立单克隆抗体制造工艺时，需要对各种条件进行仔细的优化。由工程细胞系、培养基和添加剂选择以及工艺开发引起的变化可能导致ZL用单抗的高级结构（HOS）发生变化。以下数据是我们使用RituBridge PCA ELISA试剂盒检测的数据，显示了各种极端条件：氧化、高温和高pH -对单克隆抗体Rituxan（利妥昔单抗）高级结构的影响，Rituxan（利妥昔单抗）单克隆抗体用于ZL各种形式的CD20阳性非霍奇金淋巴瘤。虽然这三种条件下都会导致单抗分子结构展开，但每种情况下展开的模式都有显著差异，在每种测试条件下都会产生不同的高级结构（HOS）变化，这个也是每个单抗独特的“指纹”。

表2：使RituBridge PCA ELISA试剂盒检测氧化、温度和pH值变化对利妥昔单抗的影响，但有些被折叠在内部的表位暴露出来时，会检测到光密度峰值的变化，这说明蛋白的高级结构发生了变化。

“栗2”

       利用PCAELISAs分析单抗高级结构(HOS)数据，增加申报数据价值

       PCA ELISAs除了评价外部理化条件对单抗的影响外，还可用于比较多批次的生物仿制药与原研单抗药物的生物相似性。下面的数据清楚地说明了候选生物仿制药物与参照的原研药物之间的极好的相似性，仅有Ab区域9存在可能的偏差。

       值得注意的是，尽管生物仿制药可能表现出与原研药物不同的高级结构（HOS)的信号指示，但这些变化也可能并不总是与临床相关。PCA ELISA检测的数据为支持研发人员向FDA提交的证据提供了重要的价值。

表3：通过与5个不同批次的原研药物与生物仿制药物的比较，说明了4个区域(5、9、17和30)可能存在性能偏差

“栗3”

不同PH值对于蛋白结构影响

表4：RituBridge ELISA检测，对照已知的低pH处理的生物相似ZL单抗。

表5：使用PCA技术检测一种新的ZL单抗(未知生物相似物)在pH诱导应力下的变化

默克ArrayBridge蛋白质

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PCA参考文献：

1. Ecker, D. M., Jones, S. D., & Levine, H. L.(2014). The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs, 7(1), 9-14.doi:10.4161/19420862.2015.989042

2. Center for Drug Evaluation and Research. (2015,April 28). Quality Considerations in Demonstrating Biosimilarity of aTherapeutic Protein Product to a Reference Product. Retrieved from https://www.fda.gov/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm290967.htm

3. Wang, X., Li, Q., & Davies, M. (2013).Development of antibody arrays for monoclonal antibody Higher Order Structureanalysis. Frontiers in Pharmacology doi:10.3389/fphar.2013.00103

4. FDA Advisory Committee Briefing Document. (2016,February 9). CT-P13 (infliximab biosimilar), Briefing Document for thearthritis advisory committee. Retrieved fromhttps://www.fda.gov/downloads/advisorycommittees/committeesmeetingmaterials/drugs/arthritisadvisorycommittee/ucm484860.pdf

5. Song, Y., Yu, D., Mayani, M., Mussa, N., & Li,Z. J. (2018). Monoclonal antibody higher order structure analysis by highthroughput protein conformational array. MAbs, 10(3), 397-405.doi:10.1080/19420862.2017.1421880

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