尾气分析质谱在哺乳动物细胞培养中的应用

细胞培养过程中，实时细胞代谢状态可以通过检测培养过程尾气中氧和二氧化碳浓度的微小变化进行表征。通过进一步计算可以获取表征细胞代谢的关键参数如氧气消耗速率（OUR）、二氧化碳生成速率（CER）以及呼吸商（RQ）。

这些关键参数的波动能够直接反映哺乳动物细胞生理状态，如细胞生长和底物消耗等，同时，这些信息的获取将有助于及时调整过程工艺参数（通气、搅拌、补料等）实现过程Z优化设计因此，利用过程尾气质谱仪对细胞培养过程尾气组分进行分析是监测工艺过程中细胞代谢状态变化和提高生产效率的有效方法。

磁质谱仪在哺乳动物细胞培养中的应用

磁质谱和四级杆这两种类型的质谱仪已用于监测哺乳动物细胞培养过程。

HaiYuan Goh等于2019年发表相关文章介绍了他们的相关研究。在5L和50L规模反应器进行Fed-batch培养过程中，使用磁质谱仪 (Thermo Scientific, Prima BT Mass Spectrometer) 进行相关气体分析。整个细胞培养过程通过切换进气中压缩空气、纯氧以及氮气组分控制溶解氧维持在30%±1%。在这种模式下，作者发现活细胞浓度（VCC）与进入反应器的进气氧气浓度之间的相关系数R2≅0.9; 因此，进气O2组分可以表征VCC。通过计算的OUR和溶解氧数据，可以对体积氧传质系数（kLa）进行定量，在整个培养期间，发现在不同的时间点添加消泡剂均会降低kLa；实时计算的整个生物反应器运行期间的特定耗氧率（qO2）为2-20 pmol /细胞/天，也与之前文献报道关于哺乳动物细胞氧消耗速率范围一致。同时，该文章diyi次报道了呼吸商（RQ）和细胞培养代谢状态之间的相关性：在乳酸产生阶段平均RQ> 1，和乳酸消耗阶段平均RQ<1。

Thermo Scientific™ Prima 质谱仪系列中的扇形磁场分析器由层压材料组成，可快速、稳定地分析无数用户自定义气体。如果质谱仪要监视多个生物反应器，可以在多流路之间进行快速切换。Thermo Fisher Scientific 开发了独特的快速多流路进样器（RMS），可快速选择多达 64 个流路的样品。

美国食品药品监督管理局（FDA）在生物医药生产领域发起Quality by design (QbD)， 要求通过采用过程分析技术（PAT），多变量数据分析（MVDA）等技术GX确定Z佳工艺条件，以减少时间成本。因此，细胞培养工艺需要更多的在线分析。应该注意的是气体大致上包括进出生物反应器的任何气体，而不于氧气和二氧化碳。传统上二氧化锆传感器用于氧气浓度测定，红外传感器用于二氧化碳浓度的测定。与质谱（MS）相比，这些技术对气体的检测范围有限，灵敏度较低。虽然质谱操作更为复杂，但可以一台设备检测和定量除了氧气和二氧化碳的多种气态化合物。以前在哺乳动物细胞培养中已成功使用MS进行气体分析。哺乳动物细胞培养过程进气速率，尤其是在小型反应器上进气速率通常远低于微生物发酵，有时接近质谱仪样品入口的Z低要求（10mL/min）。

这可能需要更长的样本流切换时间，幸运的是哺乳动物细胞培养非常长的批处理时间和更低的呼吸速率往往不需要很高的频率分析。在这项研究中，数据来自每个样本流每分钟一次的频率是令人满意的。

在哺乳动物细胞发酵中，进气成分是经常变化的混合物（例如，氮气，氧气和二氧化碳）。二氧化碳的含量从接近零到100％，这就要求气体分析质谱仪具有非常宽的动态监测范围，并且在如此宽的范围内都稳定呈线性。由于哺乳动物细胞的低呼吸率，与入口气体进行比较，出口气体中的氧气、二氧化碳浓度，产生的差异小得多，这要求气体分析光谱仪必须具备短期精度很高的测量，可以观察到这些很小差异, 从而得到有用的氧气吸收率（OUR），二氧化碳释放速率（CER）和呼吸商（RQ）。由于使用碳酸氢盐作为pH值缓冲，加上二氧化碳易溶于水，因此测定二氧化碳的变化很难。应用质谱法可以更有效地进行气体分析, 用质量平衡原理，侧重于二氧化碳的和氧气（细胞呼吸成分）的检测，并将其与气体利用联系起来。

应用图释：

△图片来源：HaiYuan Goh et al，Applications of of gas mass spectrometry in fed batch mammalian cell culture,Bioprocess and Biosystems Engineering. doi:10.1007/s00449-019-02242-2

MS检测原始气体数据得出以下参数：

氧气吸收率（OUR），kLa（对于O2），比耗氧率（qO2），二氧化碳释放速率（CER），比二氧化碳产量率（qCO2）和呼吸商（RQ）。

Fbioreactorin是进入生物反应器的气体流量，单位为mL/min；Fbioreactor out从生物反应器中流出的气体流量,单位为mL/min；FMS，in气体流入MS分析仪的流量，单位为mL/min；Vbioreactor生物反应器中培养体积；[O2*]进气中的氧气浓度以μmolL-1为单位；[O2]反应器中的氧气浓度以μmolL-1为单位；VCC，细胞活力，cell/mL；OxC和CDC是从与MS相关联的GasWorks软件获得的派生参数信息。这些信息是使用如下公式 （7–14）得出的 ：

结果和讨论

图3

图3 MS实时数据和离线细胞培养数据：

A. 5 L 反应器1的VCC与O2-in和O2-out; B. 5 L 反应器2的VCC与O2-in和O2-out; C. 50 L SUB中试反应器的 VCC与O2-in和O2-out; D. a-c的叠加; E. 5 L 反应器1: 乳酸浓度和CO2进气摩尔百分比和CO2尾气摩尔百分比; F. 5 L 反应器2: 乳酸浓度和CO2输入和CO2输出的关系; G. 50 L SUB中试反应器：乳酸浓度和CO2输入和CO2输出的关系; H. e–g的叠加.

从样本中进行例行采样（用于离线分析），5 L和50 L反应器的采样量分别为20 mL和30 mL。相比培养体积，取样体积对于尾气分析的影响可以忽略。消泡剂和补料的添加都会引起输入氧气的激增，CO2 和 N2成比例降低。这个现象也说明消泡剂的加入会降低体积氧传递系数。

有趣的是，还检测到了在细胞培养过程中两个事件。首先，在5 L规模的生物反应器中，MS检测到滤器堵塞。MS软件在夜晚接收检测信号，没有操作员在场。经早上检查MS记录数据，确定滤器堵塞。在无菌条件下更换过滤器后培养照常进行。这样的故障没有来自MS的实时气体数据就不会发现。第二，在50L培养过程中,  在某些情况下，生物反应器压缩空气供应失效，气体质谱仪检测到气体组成成分的变化。当压缩空气供应减少，50 L 反应器控制系统能够切换到不同的气体混合物以保证DO。也就是将由纯氧而不是通常的压缩空气辅以氧。而这时DO的读数没有变化。这意味着此种情况下，使用气体MS分析仪将有助于对细胞培养过程的有效追踪。针对5 L和50 L反应器的整个培养周期，计算了OUR 、kLa和qO2。5和50 L生物反应器运行合并数据图4所示，显示在不同的规模上不同参数的趋势。

图4

图4、从重复运行5 L STR和单个50 L SUB运行得出的氧气相关参数。A. OUR值; B. 在添加消泡剂后的kLa值; 

在5 L和50 L反应器上，O2-in数据如图4a所示，表明O2-in与VCC峰相关，如图3d所示。因为O2-in随着氧气消耗量（或OUR）的增加而增加，当存在更多细胞时，氧气消耗量会继续增加，反之亦然。5 L和50 L的运行的VCC与O2-in之间的相关性全都约为0.9（图5a）。根据VCC-OUR数据， 50升反应器的r2值为0.710， 5 L的r2值为0.440和0.338。这可能是由于生物反应器的体积的不准确和VCC测量缺乏足够数据点，另外从5 L系统生成的数据OUR的干扰较大。这也表明O2-in将成为细胞培养中VCC变化的更可靠的在线指标，可能是工艺控制中更好的参数。

图5

图5来自两个5 L罐和50 L SUB的VCC和气体数据的相关性。A. VCC与O2-in; B. VCC与OUR氧气利用率。

kLa可以从生物反应器进口和出口的已知气体流量、氧气浓度计算。kLa数据表明5 L生物反应器（?14 h-1）中的初始kLa高于50 L生物反应器（?7.5 h-1）。尾气分析能够捕捉到消泡剂导致kLa降低。消泡剂导致kLa下降在5 L运行中也可以观察到，尽管两次重复之间不一致（图4b）。另外，随着反应器的变化，kLa变化没有很大差异，即使在50升反应器增加了一个搅拌桨。

不同生物反应器的qO2趋势是一致的（图4c）。对于培养的前半部分，维持相对恒定的qO2，而在培养的后半部分观察到qO2相对较高。一种解释这种变化的假设是代谢从乳酸生产转向消耗。在乳酸迅速积累的时期，糖酵解是细胞的主要途径，需要相对较低氧气量。向乳酸消耗的转变可能标志氧化磷酸化，需要氧气作为Z终的电子供体。因此，在乳酸转变为纯消耗行为时，qO2变得相对较高。这分别在50 L运行第7天和5 L运行第9天之后观察到（图4c）。这几天里也发生一致相应的乳酸代谢变化（图3h）。有趣的是，从第10天开始以后，在5 L培养中qO2的值是50 L的约3倍，即使50 L细胞密度平均更高。它暗示也许5 L系统中有一个不同于50 L系统的的生理环境，导致更高的qO2。

图6

图6、呼吸商图形分布，在两次5 L和一次50 L SUB运行期间，由尾气计算，乳酸产生阶段和乳酸消耗阶段，以黄色和绿色突出显示。A. 50 L 的RQ; B. 5L的 RQ。

应注意的是，在没有二氧化碳进到生物反应器中的时期，在尾气中检测到CO2（图3e–g）。尾气中Z高二氧化碳的比例为?2％mol。系统产生的二氧化碳可能是由于来自细胞呼吸释放的二氧化碳。CER和qCO2仅在此特定时期内计算，因为有些阶段没有外部二氧化碳进入到生物反应器中。qCO2似乎在两个不同规模的3个不同反应器中具有一致性，?5 pmol / cell / day。这些数据和Goudar等人报道一致。

RQ与细胞培养代谢状态之间的关系。RQ可以用作细胞培养代谢状态的变化指标。来自MS的气体数据能够提供实时RQ数据（图6）。显然， 如前所述，由于添加补料和消泡剂的结果引起的气体峰值，在图4b中，也影响了RQ。重复的两次5 L反应器的RQ峰（图6b）并非完全相同。这可能标志在将气体输送到每一个5 L生物反应器中的方式上存在实际的物理差异。主要可能是气流量，进入生物反应器和进入MS改变的气体需求引起波动。另外，两个反应器都由串联的相同气源供给，所以进气流量变化的影响可以根据每个反应器所要求的气体而变化。这些数据干扰项在50升系统中的问题较少，使RQ图形更易解释。乳酸的代谢（生产或消耗）状态和每个代谢过程中的近似平均RQ值之间显示了相关性。50 L反应器比5 L更加明显。如果忽略补料和消泡剂添加对RQ的影响，平均RQ值在乳酸生产阶段为> 1，而乳酸消耗阶段为<1（图6a）。单纯利用碳源（如葡萄糖）的 RQ值为1，同时氧化更多还原性分子（如氨基酸）和脂肪酸会导致RQ <1，因为需要更多的氧气来完全氧化这些分子。在乳酸生产阶段，糖酵解是主要的代谢途径，高的比葡萄糖消耗率（数据未显示）和相对较低的qO2，因此RQ更高。另一方面，在乳酸消耗阶段，TCA活性较高涉及的氧化磷酸化导致更低葡萄糖消耗率（数据未显示）及相对较高的qO2，Z终导致较低的RQ。以前在摇瓶和深孔板实验中已经证明，这种在高和低的糖酵解与产生乳酸和消耗乳酸之间的相关性。对200多个具有产生乳酸/消耗乳酸的生物反应器数据的多元分析表明，相对于其他任何参数，乳酸的产生到消耗转变更多与糖酵解能量流降低有关。

气体分析的潜在应用

尾气MS分析仪有潜在的多种应用，可能包括：

1. 磁质谱可以检测非典型气体成分像硫化氢（H2S，低至ppm范围），并用作细胞代谢压力或产品质量属性的指标。

2. 尽早发现基于气体分析的微生物污染，可以Z 大程度地减少批次终止的决策时间。

3. 预定质量标准范围内评估批次之间的差异，有利于在不同生产地点和生物反应器平台进行技术转移。

结论

综上所述，使用磁质谱进行气体分析成功在5 L和50 L进行分批补料的哺乳动物细胞培养实现。实时进气中氧气百分比mol分压与不同细胞培养阶段的相关性很好，尤其是VCC。观察到培养物中的乳酸和尾气二氧化碳分压之间负相关的关系。在整个培养持续周期内，仅从尾气数据中可以计算kLa 。此外，可以从气体分析中可以发现影响kLa的特定动作，例如消泡剂的添加。Z后，观察到的RQ 足以显示培养期间乳酸的生产/消耗阶段的相关性。预计这些技术仍然适用于工业GS-CHO细胞系。

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