化学发光Western Blot的流程大家再熟悉不过,近红外荧光Western与化学发光步骤基本相似,但是有些小伙伴做不好荧光Western,小编给大家总结了做荧光Western的几点注意事项:
一、做近红外荧光Western选择低荧光背景膜,降低膜对信号的影响。
二、选择合适的封闭液,没有一种封闭液适用所有的Western Blot检测,需要大家进行优化,如果做磷酸化蛋白检测,不建议使用牛奶为基础的封闭液,如果做酪氨酸蛋白,不建议使用BSA为基础的封闭液,Azure提供荧光封闭试剂,减少非特异性条带结合,降低背景。
三、漂洗也是非常重要的一步,使用干净的孵育盒,足够多的漂洗液,一般含有吐温的浓度0.1%-0.2%,如果背景特别高,加入少量的SDS可以明显降低背景,SDS添加只能用于PVDF膜,浓度一般为0.01%-0.02%。Azure提供荧光印迹漂洗buffer,减少荧光二抗的非特异性结合,从而产生高信噪比的印迹。
四、选择特异性好的抗体,两种一抗必须来自不同的宿主,才能被不同特异性的二抗所识别。Azure提供荧光标记试剂盒,荧光Western Blot实验试剂盒和近红外二抗,满足客户的需求。
五、近红外荧光印迹膜的成像,需要成像仪器具有近红外荧光光源,现在进行近红外染料激发zuihao的激光光源,Azure Imager和Sapphire都采用的激光光源,具有激发强度大,单色性好,信噪比高,背景低等特点。
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