荧光,在生物实验领域是一种很常见的工具,在实验室应用方便且用途广泛,无论是定性还是定量,计数还是成像,荧光相关实验都能满足需求。一台操作便捷、清晰跟手的荧光显微镜往往比高端仪器赢得的Respect更多。荧光可以为细胞实验做些什么?它的工作原理又是什么?一起来看!
一、什么是荧光
荧光是激发态分子不通过内部转换方式消耗能量回到基态,而是释放出相应较低能量的光量子。
荧光物质都具有两种特征光谱:激发光谱和发射光谱。不同荧光物质有其最敏感而有效的激发波长,因而选择合适的激发/发射光谱以获得ZJ的结果,是实验中首要考虑的问题。在研究中常见的荧光相关参数都是相对应的,比如AO-DNA(500/526)、AO-RNA(460/650)、PI(535/615)、DAPI(359/461)、FITC(493/517)以及GFP(498/516)等。
二、荧光在细胞实验中的应用
荧光染色计数
细胞实验中,荧光的应用频率可以说是很高的,只要涉及有关量的细胞实验,就需要细胞计数。常规的活细胞计数法,推荐使用台盼蓝染色。但在培养原代细胞或分离PBMC时,残留的RBC被台盼蓝拒染,无核细胞的干扰会影响整体的结果判定。而AO/PI染色计数便能解决这一问题!
AO具有膜通透性,可以通过完整细胞膜,使核DNA和RNA染色,同时在凋亡细胞中,因染色质固缩或断裂为大小不等的凋亡小体,AO使其染上黄绿色荧光,坏死的细胞黄荧光减弱甚至消失,呈现细胞核碎裂点状大小不一、质密浓染。
PI无膜通透性,只能通过不完整的细胞膜,因此只能使所有死细胞的细胞核呈现红色荧光。
AO/PI特异性染色可以准确区分死活细胞,此外实验室常用DAPI进行染核。DAPI是一种能与DNAQL结合的荧光染料,结合到双链DNA上的荧光强度提高约20倍。在实验过程中,固定细胞后导致细胞膜通透性增加,再加上DAPI的强结合性,便可高敏感性显示出基因表达的亚细胞情况,进行基因定位。
荧光蛋白
常见有绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)。
使用较多的就是GFP,通过基因工程将其转入基因组持续表达。在北冰洋寒冰水域,维多利亚多管水母体内发现了GFP,后有三位科学家分别将其投入试验研究,并进行荧光的加强改造,ZZ获得了2008年的诺贝尔化学奖。
广泛应用后,GFP在显像技术、示踪技术、报告基因等应用中大放异彩。由于其独特的光信号转到机制,研究者将具有信号转导的分子识别点,结合到荧光蛋白分子上设计生物感受器。可检测核酸、激素等多种分子的表达状况,甚至还能检测活体细胞中蛋白的构象变化,具有较为广阔的应用前景。
三、C100自动细胞计数仪荧光功能
实验室在做真核细胞转染时,一般都会将GFP连入质粒,通过荧光的表达,再通过DAPI定位细胞核检测转染的效率。
效率又是如何计算的呢?粗略估算?手动计数?用流式细胞仪?费时费力不说,约仪器还麻烦。瑞沃德新款自动细胞计数仪C100荧光功能可快速准确计算结果细胞数量,为您的实验保驾护航。
荧光展示图
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