传统的Western Blot,耗时长,手工操作多,重现性差(CV>35%)。遇到珍贵样本(蛋白量不足)通常会进行strip-reprobe(洗脱-重杂交)的方式进行蛋白质多靶点的分析。
然而,传统Western Blot进行strip-reprobe(洗脱-重杂交)时会面临:
1.洗脱次数不够,无法充分解离靶点和抗体,影响二次杂交。
2.洗脱次数太多,膜上靶点丢失太多,定量更加不准。
3.每个靶点和抗体亲和力不同,没有通用试剂和方法。
为了克服这些局限性,
ProteinSimple Jess RePlex技术正式上线!!
Jess RePlex检测技术特点:
只需1份3μl样本(分选干细胞、免疫微环境细胞、珍稀临床样本等)
2次连续自动检测:一根毛细管洗脱-重杂交技术
结合Jess多通道检测:化学发光、双色红外荧光、总蛋白检测通道
实现珍贵样品多靶点的定量检测分析(不同靶蛋白、靶蛋白不同亚型、靶蛋白磷酸化、样本总蛋白等)
Jess RePlex检测原理:
Jess RePlex应用举例:
RePlex超高的洗脱效率
RePlex中的关键步骤是在DY轮探测后能有效去除抗体。因此,评估了针对Jurkat和MCF7裂解物的pan AKT/AKT1/AKT2/p-AKT1/p-AKT2/p-GSK3b抗体的去除效率。结果显示,所有测试的抗体均显示出超过96%的去除效率,而大多数测试的抗体均显示出98%或更高的去除率。这些数据表明进行第二轮抗体探测时,与DY轮探测几乎没有交叉。
RePlex出色的重杂交信号强度和高重复性
为了证明探针1和探针2之间的信号强度和可重复性没有受到影响,在两个检测步骤中测量了MCF7裂解物中AKT1和AKT2抗体的信号强度。结果显示,不管检测每种蛋白质的顺序如何,在RePlex分析中在探针1或探针2中检测到的MCF7裂解物中的AKT1和AKT2在两个检测周期中均具有出色的重现性和相似的信号强度。
一份样品不同靶点的检测
RePlex检测技术可以检测同一样品中多种蛋白质磷酸化的状态变化,并对其进行定量分析(使用对照和经LY294002处理的Jurkat细胞的裂解物的p-AKT/p-GSK3b/p-cRaf的定量分析)。
一份样品相近分子量靶点的检测
利用RePlex技术表征了多种组织类型中AKT的磷酸化状态。同一毛细管中检测多种组织类型,包括肝,肾,结肠,脑,乳腺和肺中的panAKT和p-AKT。同时分析了不同组织中归一化panAKT后,p-AKT信号的变化,即不同组织显示出不同水平的AKT表达和磷酸化。
一份样品多靶点的检测
利用RePlex技术可以在DY轮免疫杂交中进行不同靶蛋白的测定,并在同一毛细管中进行第二轮总蛋白检测。利用未经处理和用人IGF1(hIGF1)处理过的MCF7细胞,DY轮检测Pan AKT(NIR通道)和p-AKT(化学发光通道),第二轮检测同一根毛细管中的总蛋白。结果显示,利用Jess不同通道以及RePlex技术可以达到一份样品获取多个靶点的定量数据。
结论:
传统Western Blot若从单个样本中获取更多的蛋白信息,即为了节省珍贵或昂贵的样品,需要进行strip-reprobe(洗脱-重杂交)。然而,众所周知该技术会遭受不可预测的蛋白质损失,并且通常需要冗长的优化以实现zui佳的剥离效率并使蛋白质在印迹上的保留zui大化。这使得几乎不可能使用标准的条带和探针技术进行任何定量分析。相比之下,Simple Western平台Jess开发的RePlex技术是一种优化的自动化两步免疫分析,可以实现多个靶标的gao效抗体去除和出色的目标蛋白在样品毛细管中的保留,从而可以实现在一个样品中获得更多的蛋白信息。
更多RePlex信息请咨询ProteinSimple销售或技术人员。
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