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单分子成像:实话讲,sCMOS真心倍儿香!

滨松光子学商贸(中国)有限公司    2020-08-28    CMOS相机    浏览 306 次

做成像的小伙伴大抵都了解,在单分子成像中,信号往往是极弱的,如何从背景噪声中pick出有效信号,是关键所在。为减小背景荧光(来自细胞的自发荧光等等)的影响,一般会采用“TIRF技术+科研级相机”进行成像。并较一般的成像应用,在灵敏度方面,单分子成像对相机的性能要求更为苛刻。

 

EMCCD相机在很长段时间里,都是单分子成像的心头好。一骑绝尘的量子效率(QE)外加电子倍增技能BUFF,妥妥站稳C位。除了贵,别的没什么毛病。

 

不过,随着sCMOS技术的持续发展,sCMOS相机稳步地立起了自己的山头。除拥有了更高的帧速、更多的像素数目、更高的分辨率,灵敏度/信噪比也得到了明显的提升。


滨松sCMOS相机(ORCA-Flash 4.0等第二代系列产品)从2015年左右开始,就逐渐被用于了STORM等基于单分子成像的超分辨技术应用中,以获得更高的帧速、分辨率。

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滨松两款高端sCMOS相机与CCD相机的性能比较


而背照式sCMOS技术的出现,让sCMOS相机阵营又得到了一次飞跃。除了QE已达到与EMCCD相当的水平,受益于越来越低的噪声,信噪比也获得了进一步的提升。进而,对于单分子成像中信号较弱的场景,有了足够的灵敏度。一方面,成像质量几乎达到了媲美EMCCD的程度;一方面,价格较其还肉眼可见的成倍降低。


这性价比,就说,香不香吧!

拿滨松2020年发布的shou款背照式sCMOS相机ORCA-FusionBT来看。530万像素(2304x2304),配合6.5μm的像素尺寸,提供了出色分辨率;信噪比(SNR)方面,两个关键影响因素也做到了十分优秀的水平:QE高达95%,读出噪声低至0.7erms。

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滨松背照式sCMOS相机ORCA-FusionBT

下面两个案例,可以看到这台背照式sCMOS在单分子成像中的优秀表现,特别是与EMCCD的成像对比:


案例 1

YFP标记的膜蛋白单分子TIRF成像

可见滨松ORCA-FusionBT sCMOS相机与EMCCD相机的成像效果对比。

案例 2

ORCA-FusionBT sCMOS相机的单分子成像案例

荧光探针为TagRFP,此案例采用了双色成像。

看到上面的成像效果,大家也就能体会到,单分子成像在相机选择上的“移情别恋”,也是必然的了。

 

而在第二个案例中,我们看到,该实验采用了双色成像。单分子成像经常与FRET技术联用,用于在单分子层面研究分子的构造变化(如蛋白质分子domain之间的距离变化等等)。


由于FRET技术需要对两个波长同时监测采像,所以一般会在相机和显微镜之间加装双色分光器,通过二向色镜/滤光片按照波长将信号分开,并分别成像。

 

针对这样的需求,滨松还可供“相机+双色分光附件”的双色同步成像方案。方案可分为单相机方案与双相机方案两种,前者成本较低,后者则有更大的视野范围以及更多扩展功能(如物镜后焦面成像、PSF修饰等)。

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滨松双色分光附件W-View GEMINI系列

 

使用这套的双色成像方案的单分子FRET成像案例,可以参阅The bright future of single-molecule fluorescence imaging, Curr Opin Chem Biol. (2014) 20:103-111这篇文献。其中,作者采用滨松sCMOS相机与W-View GEMINI双色分光器配合,得到了zui高2ms时间分辨率的单分子FRET成像,分析了核糖体pre-translation complex的动力学结构变化。


Ok~单分子成像此次就聊到这里。而关于刚刚提到的单相机双色同步成像、双相机双色同步成像这两套方案,咱们就在下一期推文中,再为大家做详细介绍啦~欢迎关注~

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