荧光成像需要对检测的细胞或分子进行荧光标记。标记方法主要有两种,DY种利用内源荧光信号,在细胞中表达荧光蛋白进行标记;第二种利用荧光分子对细胞、药物或纳米颗粒等分子进行标记。目前,很多荧光蛋白被开发并应用到活体成像,如何选择合适的荧光蛋白呢?本期将为大家介绍!
Rainbow of fluorescent proteins [Tsien lab]
选择荧光蛋白应考虑的五大因素
1 激发波长/发射波长
每一种荧光蛋白都有其独特的激发波长和发射波长。因此,选择的荧光蛋白必须是所用成像系统能够激发和检测到的。比如,使用的成像系统只有两个激发光源:488 nm和561 nm。那就不可以选择远红外荧光蛋白。同时使用超过一个荧光蛋白时,必须确保发射波长没有重叠。
荧光蛋白应用于活体成像实验时,尽量选择红色或近红外的荧光蛋白,这类荧光蛋白的发射波长较长,具有更好的组织穿透能力。
2 寡聚反应
早期开发的荧光蛋白易于寡聚化,与目的基因融合表达时,可能会影响目的基因蛋白的生物学功能。建议使用单体的荧光蛋白,比如mCherry。
3 亮度
荧光蛋白的亮度值由消光系数与量子产率的乘积计算得出。在许多情况下,将荧光蛋白的亮度与EGFP(设定为1)进行比较,有一些荧光蛋白非常暗淡(例如TagRFP657,其具有亮度只有0.1)。因此活体成像实验时,亮度也需要考虑。
4 pH稳定性
如果计划在酸性环境中表达荧光蛋白,则此参数非常重要,一些荧光蛋白具有不同的激发/发射光谱(例如mKeima),或在pH变化时荧光强度会发生改变(例如pHluorin,pHTomato)。
5 避免自发荧光
生物体自身的很多物质具有较强的自发荧光,如指甲、毛发具有强烈的绿色背景信号。因此活体成像时,需要对动物进行完全脱毛处理或尽量避免绿色荧光蛋白,可选RFP、dsRed, mCherry, mTomato等荧光蛋白。
选择好荧光蛋白后,接下来就是做实验了。
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成像结果展示
对绿色荧光蛋白表达的肿瘤与Cy5.5标记的药物进行成像
对绿色荧光蛋白表达的大米进行成像
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