定量方法知多少--相对定量

在荧光定量PCR检测实验中可以采用多种方法来进行基因的定量。定量的方法也取决于实验的目标。当实验者对待测样品中的核酸的具体拷贝数比较感兴趣时，可以选择JD定量。如果实验者关注的是实验样本与对照样本之间的倍数变化，无需精确测定拷贝数，则选择相对定量。目前相对定量方法适用于大多数基因表达研究，可分析对照样本和一个或多个实验样本中目的基因表达水平的上调或下调。

在此我们将详细介绍目前使用广泛且适用于基因表达研究的相对定量方法：2^-ΔΔCq法。首先相对定量也需要仔细规划，实验生成的数据是相对丰度，而非确切的基因拷贝数。

相对定量方法--2^-ΔΔCq

2^-ΔΔCq法是一种非常普遍的技术，它比较了包括对照样本 (如未处理或野生型样本) 和内参基因 (如看家基因表达) 在内的实验样本的结果。采用该方法，可根据检测样本和对照样本中内参基因的Cq来调整相同样本中的目的基因的Cq。ZH得出的ΔΔCq值可用于测定目的基因表达量的倍数差异。具体计算方法如下：

该方法要求内参基因和目的基因具有相一致的扩增效率，并尽可能接近100% 。确定扩增效率的方法是采用同样的样本进行梯度稀释，生成内参基因和目的基因的标准曲线（下图）。确定内参基因和目的基因的扩增效率是否在90-110%的范围内，且相互间效率偏差在5%以内。

内参基因的必要性

内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。理想的内参基因应该满足以下条件：

① 不存在假基因(Pseudogene)，以避免基因DNA的扩增；

② 高度或中度表达，排除低表达；

③ 稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞)，而且其表达量是近似的，无显著性差别；

④ 表达水平与细胞周期及是否活化无关；

⑤ 其稳定的表达水平与目标基因相似；

⑥ 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。

内参基因的评估，可通过geNorm、BestKeeper、NormFinder、RefGenes 等工具来评估，这是保证结果可靠准确的前提。其次可对候选的内参基因进行qPCR 实验做进一步的筛选。在不同样本中均稳定表达的内参基因，即比较各样品中Cq平均值以及Cq值的标准偏差，选择SD最小的基因作为实验内参。

Azure CieloTM实时荧光定量PCR系统——相对定量示例

1、实验方法

方法:从组织中提取RNA，逆转录成cDNA，以SYBR Green法进行荧光定量检测。

试剂:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)

实验步骤:提取RNA→cDNA合成→设计特异性引物→qPCR扩增→结果分析。

2、结果计算

Step1:ΔCq值=目的基因Cq–内参基因Cq

Step2:ΔΔCq值=处理样品ΔCq–对照样品ΔCq

Step3:ZH计算出倍数关系: 2^-ΔΔCq值

3、相对表达量结果：

Azure Cielo™实时荧光定量PCR

来自美国Azure Biosystems公司，以创新服务于生命科学为愿景。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统融合了高品质Peltier温度模块和基于光纤传输的光学检测系统，为您的科学研究提供高jingzhun、高灵敏的可靠结果。Azure Cielo 3/6检测通道，可根据实验需求灵活配置。同时配有10.3触控系统，主机本身可独立运行、连接、远程交互，让您随时随地知悉实验进程和及时获得实验结果。

申请SY

关注“深蓝云生物科技”公众号→云活动→免费SY；您也可以登录深蓝云官网：点击首页右上角的SY申请进行填写。