直播回顾 | 抽丝剥茧，超多重免疫标记解密肿瘤微环境之奥秘

4月20日上午，徕卡与转化医学网共同举办了网络研讨会——“抽丝剥茧，超多重免疫标记解密肿瘤微环境之奥秘”。徕卡生命科学部的高级应用专员刘继红和Cell DIVE应用科学家Michael Smith为广大观众揭示了CELL DIVE 超多重标记解决方案如何轻松应对复杂的肿瘤微环境，为临床肿瘤的研究和治 疗提供了优秀的研究工具。Indica Labs应用科学家赵永田重 点介绍了在HALO中对获取的Cell DIVE图像的处理、分析步骤以及如何进行高纬的空间生物学分析，用以了解肿瘤微环境中肿瘤细胞和免疫细胞的相互作用关系对研究肿瘤免疫应答的作用机制。

01

CELL DIVE使用的抗体是开放的吗？有大约多少种经过验证的抗体？

A：CELL DIVE 的抗体是开放的，有350种以上的抗体经过验证的抗体可以使用。

02

CELL DIVE可以在临床上用吗，是否有注册证？

A：目前没有注册证，正在申请中。

03

这个平台的检测联系哪位呢？

A：可以联系Leica公司各地的应用支持和销售。

04

这个染色是仪器自动染色吗？

A：可以手动染色也可以和自动染色仪联用自动染色。

05

哪个实验室可以检测？

A：Leica公司有DEMO机，可以提供一定的演示。

06

成像是全片还是一个视野？

A：成像仪可以选择全片成像或者选取一个或多个视野成像。

07

怎样避免非特异性染色 ？核阳性的和胞浆包膜可以随意搭配吗？

A：首先要选择特异性好的抗体，我们抗体库的抗体都是经过验证的抗体。

细胞核阳性和胞浆包膜理论上可以自由搭配。

08

每一轮染完了，除了染料失活，是不是还需要去除一抗？

A：每一轮染色成像完成，染料失活 不需要去除一抗。

09

CELL DIVE是不需要摸索一抗浓度的吗，固定的protocol会不会造成有的组织染不出来有的组织却染色过强？

A：徕卡的protocol适用于绝大多数的组织，有些组织的某个marker 表达特别高或者特别低，可能需要修改抗体浓度。

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抗体是什么方法学检测标记？除了主讲人介绍的荧光滤镜，能否使用其他的荧光标记和滤镜？

A：抗体验证时参照同样marker的免疫组化的结果；为了减少串色的发生，我们推荐使用Cy2、Cy3、Cy5、Cy7光谱基本相同的染料标记。

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成像也是设备自动化进行的吗？

A：成像时设备自动进行的，但是可以在拍照前根据样本的染色情况进行优化。

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Did you find any nonspecific staining while utilizing the different CD markers for immune cells?（Michael Smith）

A：The Cell DIVE solution comes with a list of 350+ antibodies that have been validated for use with the workflow, and for specificity and sensitivity. For antibodies that are not used from the list, we provide details on a three part antibody validation process that also ensures that antibodies used are specific. In the case of residual nonspecific signal, this is likely removed by the autoflourescence imaging and removal of that signal that occurs at every round. So, in our hands, nonspecific staining is minimized at the level of antibody quality control and the image processing that the software performs.

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关于细胞间邻近距离的分析，我们如何设定所计算的距离范围？

A：关于细胞间邻近距离的分析，所定义距离的范围目前还没有相应的标准。考虑到不同细胞亚型的相互作用，不同免疫细胞亚群之间邻近距离的设定可能需要不同的标准。在分析中，HALO可以对距离进行设定，并按照不同的区间（例如0~5μm，5~10μm，10~15μm……）给出邻近细胞的数量和密度。分析中先进行预分析，根据不同距离范围内免疫细胞的密度和临床信息进行相关性分析。再把确定的距离应用到所用的样本切片中。

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在分析过程中，我们可以选择局部视野进行分析吗？还是仅能对全组织切片进行分析？

A：分析中，我们建议针对全景组织切片进行分析，但HALO也可以定义ROI区域进行选择性的视野进行分析。这两种分析方法在HALO里都可以实现的。