“沃”的实验 | 免费直播！脑缺血模型构建及检测，助你快速掌握要领！

实验动物该怎么选择？

不同脑缺血模型，弄不清对应构建方法？

常用的血流监测技术，你都掌握了吗？

「全线赋能·“沃”的实验」之实验方法实战教程

直播第五期为大家聚焦

《脑缺血模型构建及检测》

从实验动物的选择、不同模型的分类

各个模型的构建方法到血流监测技术

两位老师将进行综合详细的讲解

全面助力你的科研实验研究

直播时间

6月21日（周二）19：00

报名方式

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主题：脑缺血模型构建

• 脑缺血研究背景

• 脑缺血动物模型构建

• 脑缺血模型构建实验仪器

讲师：孙绍强

瑞沃德行业解决方案专家，在膜片钳/钙成像/干细胞诱导方面有着丰富的实验经验，曾参与多项重大研发及自然科学基金项目，曾在Cell Stem Cell 上发表论文，专注于神经疾病，脑缺血及神经退行性疾病模型制备和机制研究，已为上百家客户提供专业的神经疾病整体解决方案。

主题：脑卒中研究中的血流监测技术

• 激光多普勒

• 激光散斑

• 超声多普勒

• 核磁共振成像

• 双光子显微镜

讲师：殷维君

瑞沃德微循环监测解决方案专家，在生理信号监测和血流血氧成像领域拥有丰富的经验，主导动物活体成像解决方案的设计及优化，专注于临床及临床前微循环监测解决方案的构建。

上期直播间互动问题

这次我们全部为小伙伴解答

Q1：组织剪切的大小有没有具体要求，肿瘤组织一般2-4mm可以吗？

A1：这要根据组织类型去判断，一般会预处理成10mm左右的组织块，太大可能会导致处理不完全，太小可能导致细胞死亡增加，甚至导致样本变稠等。

Q2：细胞活率80%就可以了吗，看到一些资料写的都要90%以上。

A2：这个需要根据下游实验的需求灵活调整，如果样本存活率不能达到要求的话，除了优化实验条件以外，还可以通过一些死细胞去除的试剂来优化已获得的样本。

Q3：低温解离细胞与常规的37度制备单细胞优势分别是什么？区别是什么？

A3：37℃条件下进行组织解离，由于细胞转录活跃，因此解离过程中基因表达可能会发生改变，可能会干扰应激反应相关基因表达，所以在进行snRNA-seq时可以通过使用冷活性酶释放细胞核，同时一些热敏感或者脆弱的细胞更适合采用低温解离的分离方式，但是低温条件对一些质密难解离的组织的处理效率可能会降低。

另外，温度对不同细胞种类也有一定影响，比如在进行脑组织解离时，热解离可能会影响神经元和星形胶质细胞的获取，但是会大量富集小胶质细胞，所以在进行组织解离时，根据获得目的细胞的需求要灵活调整解离方案。

Q4：裂红处理有什么注意事项吗？

A4：如果直径6-8μm的细胞占比较高，且有核率偏低，这表明红细胞含量可能较多，需要进行红细胞裂解，如果红细胞裂解依然不干净，不建议增大裂解体系，建议适当延长裂红时间，或适当增加裂红次数。

Q5：流式染色时间及温度如何选择？

A5：染色本身取决于抗体抗原之间的结合能力，染色时间和温度，受限于抗体浓度，一般根据选择抗体的说明书推荐的浓度和孵育时间、温度选择。我的实践经验：当不清楚说明书的情况，我会选择室温染色12-15min（取决于抗体浓度微调），或4度冰上30min。注意染色时间尽量不要让细胞破损，否则死细胞碎片会影响流式结果。此外细胞消化完毕后应该尽快染色处理，特别是一些凋亡染色、胞内酶染色为保持细胞物质活性，应尽快染色。

Q6：请问流式细胞实验中单抗进行荧光需要什么样的对照？

A6：关于对照设置，这个比较复杂，一般我们是选择同型对照作为阴性对照组，得到的结果往往是比较好的。所谓的同型对照就是同种属同亚型、相同荧光标记物、使用剂量和浓度相同，且属于非特异性结合的抗体为同型对照组。通常用来消除抗体与抗原的非特异性结合造成的背景染色。 

还有一类就是最常见的纯阴性对照，检测细胞群不进行任何抗体处理，直接进行流式检测，这就是简单消除细胞和溶剂本身的影响，这种方法的好处是节约抗体，毕竟抗体很贵。

Q7：如何减少补偿的干扰？

A7：补偿干扰往往是多激光的流式仪器才会发生一定干扰情况，此时，可以根据抗体公司提供的染料搭配方案选择比较好，也就是发射光谱的波长峰尽量不重叠的染料，这样补偿干扰会尽量消除。因此，往往需要查看染料的波长范围，此外，对于4色以上的多色标记情况，一般不常见，此时往往染料的波长范围难以避免的重叠，这时候，推荐使用抗体公司推荐的配色方案，尽量避免发射光谱的重叠。此外很多流式仪器配套软件都带一定算法对补偿进行修正，可以适当修正这个影响。

Q8：细胞自发荧光如何解决？

A8：细胞自发荧光往往是细胞内物质带有荧光，植物细胞因为叶绿素原因会自带一定荧光，然后一些药物处理下，药物本身带有发色基团，也可能自荧光，此时，纯阴性对照的设置可以补偿一定的情况。然后就是染料的选择情况，染料荧光波长范围避免与细胞自发荧光的波长的重叠，这样会比较好一些。我之前做药物的细胞凋亡实验时候，考虑到药物的情况，就没有使用常见的凋亡检测的Annexin V染料，而改用Annexin V-APC 。尽量设置纯阴性对照、有条件做下同型对照，往往可以在数据处理时候适当减少部分因素的影响。这样流式的结果会更好。

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