免疫荧光应用-巨噬细胞在ibidi腔室载玻片，通道载玻片中的培养处理

　　1. 基本信息

　　下面的应用描述了小鼠巨噬细胞系RAW-264.7（生物安全等级2）在ibidi µ-Slides VI 0.4 和8孔腔室载玻片的培养方案。这是一个特殊的细胞系的例子，用于显示粘附时间，细胞密度和细胞形态的示范。本应用可根据您的具体实验要求进行调整。

　　2. 材料

　　在设置中应用下列材料：

　　·RAW-264.7 (murine macrophages, CLS - Cell Lines Service, Biosafety Level 2) 

　　·Medium: RPMI 1640 with 2 mM L-Glutamin and 10% FBS 

　　·µ-Slide VI 0.4, ibiTreat （ibidi 80606）

　　·µ-Slide 8 well, ibiTreat （ibidi 80826）

　　·Accutase (PAA Laboratories GmbH) 

　　·1x Phosphate buffered saline (PBS) 

　　3. 细胞培养与材料制备

　　在将细胞接种到玻片中之前，按照常规的方法培养细胞。

　　µ-Slide VI 0.4 ：通道玻片和培养基，在37℃和5%CO2培养箱中培养过夜。这对于避免随着时间的推移出现气泡至关重要。为此，在50 ml器中填充适量的培养基，并轻轻地将瓶盖拧紧。在 µ-Slide 8孔载玻片开放孔井中，气泡可排出到大气中。

　　拆开µ-Slide的包装，把它放在µ-Slide支架上，并在准备细胞悬浮液时同时将盖子放在 Luer 适配器/孔上。

　　4. 播种细胞

　　分离细胞：

　　吸出培养瓶中的培养基，并用PBS洗涤细胞一次。每75cm² 烧瓶中加入3-5 ml的Accutase，并将烧瓶放入培养箱中以加快分离速度。如果是RAW-264.7细胞系，则大约需要8分钟。使用Accutase分离的细胞存活率更高。

　　4.1. 将细胞接种到µ-Slide VI 0.4中

　　在µ-Slide VI 0.4建议的细胞浓度：最终细胞数  0.3 x 10 5 cells/cm²，制备浓度6 x 10 5cells/ml。通过将移液器尖端直接放在通道的入口上，将30 µl细胞悬浮液填充到每个通道中。将盖子盖在玻片上，在37°C和5％CO2下孵育半小时以固定细胞。

　　细胞贴壁后，分别用60 µl无细胞培养基填充储液池。 避免将移液器吸头直接指向通道的入口。将玻片放回培养箱中。

　　图1：接种后一小时，在ibiTreat µ-Slide VI 0.4（货号80606）中的RAW-264.7

　　图2: 在ibiTreat µ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7，孵育24小时后

　　图3:在ibiTreat µ-Slide VI0.4中的RAW-264.7，培养四天后

　　4.2 将细胞播种在µ-Slide 8 well 中

　　在µ-Slide 8 well建议的细胞浓度：最终细胞数 0.3 x 10 5 cells/cm² ，制备浓度 1.1 x 10 5 cells/ml。将300 µl 的细胞悬浮液注入各孔中。将盖子盖在玻片上，在37°C和5% CO2中孵育。不需要进一步添加培养基。

　　图4：在ibiTreat µ-Slide 8 well(货号：80826)中的RAW-264.7，播种后1小时

　　图5: 在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，孵育24小时后

　　图6：在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，经过四天的培养

　　为获得最佳的分布的匀的细胞，我们建议使用像µ-Slide VI 0.4 这样的通道载玻片。在8孔腔室载玻片中，细胞密度可能会在孔的整个表面上因点而异，具体取决于细胞播种过程中的处理。

　　5. 免疫荧光染色

　　像往常一样为您的细胞固定和染色。

　　注意：在 µ-Slides 中染色时注意液体的处理

　　µ-Slide VI 0.4 ：更换液体，先吸出两个储液池而不排空通道。 如果您使用的是真空设备，请注意不要将吸头直接放在通道的入口上。 用100 µl新溶液冲洗通道3次。 从一侧添加新的溶液，通过通道流入另一个储液池，然后从另一侧吸出，直到两个储液池都排空。注意通道永远不要干涸！

　　µ-Slide 8孔载玻片：在 µ-Slide 8孔中，无需特殊处理措施。像在任何其他培养皿或孔板中一样的交换液体。

　　下文中，给出了使用以下材料对细胞核和肌动蛋白丝进行染色的示例：

　　细胞核：DAPI（Diamidino pheylindol dihydrochlorid） SIGMA, 32670 

　　肌动蛋白丝：Phalloidin, Alexa Fluor ® 488 Conjugate, LONZA, PA-3010 

　　1. 用3.7% 的PFA在PBS（pH 7.4）中室温下固定细胞10分钟。

　　2. 用PBS清洗细胞三次。

　　3. 用Triton X 100（0.1%）孵育细胞5分钟。

　　4. 用PBS清洗细胞三次。

　　5. 用1%牛血清白蛋白在PBS中孵育20分钟。

　　6. 用PBS清洗细胞三次。

　　7. 在0.2μm浓度下用鬼笔环肽Alexa For 488孵育细胞20分钟。

　　8. 用PBS清洗细胞三次。

　　9. 用DAPI（0.5μg/ml）孵育细胞10分钟。

　　10. 用PBS清洗细胞三次。

　　11. 完全吸出通道并用ibidi封片剂重新填充。 现在样品可在显微镜上观察了。保存在阴暗阴凉处可储存数周。

　　图7：在 µ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7用DAPI（细胞核、蓝色）和Phalloidin, Alexa Fluor ® 488 Conjugate（肌动蛋白丝，绿色）