样品制备 — 从基质中分离出目标分析物,并尽可能去除干扰,是生物分析工作流程的关键组成部分。为了获得准确、精密、可重现的实验结果,往往需要熟练且有经验的分析人员,因为任何错误或不一致都可能导致定量不准确或重做。这些错误或不一致包括在生成校准曲线和QC样品时的移液错误、遗漏或错误标记的样品、不正确的试剂添加等情况。
将自动化引入生物分析实验室不仅有助于最小化或消除这些挑战,还可以解放分析人员的双手,使其能够从事其他更高价值的工作。
下面小编就向大家介绍如何使用Andrew+移液机器人制备校准曲线,对QC样品(血浆中的多种小分子药物)进行稀释。目标分析物包括乙酰唑胺、扑热息痛、泼尼松、2-甲基苯甲酰胺、可的松、美托洛尔和阿米替林。然后,使用Andrew+搭配Extraction+模块,对样品进行全自动SPE。制备好的样品使用LC-MS进行定量分析,获得校准曲线结果以及重现性和回收率指标。
图1. Andrew+搭配Extraction+ SPE新模块,执行自动化SPE样品制备和LC-MS分析工作流,分别使用Oasis HLB SPE小柱和SPE萃取板。
优势
使用Andrew+ Robot搭配Extraction+固相萃取新模块,可实现标准曲线制备、QC样品稀释和无人值守的全自动SPE工作流;
OneLab软件拥有简洁直观的用户界面,便于用户轻松设计和执行各种自动化样品制备方案,轻松实现方法创建和方法转移;
1cc、3cc和6cc固相萃取小柱或96孔萃取板均可在Extraction+互联设备上实现固相萃取;
受OneLab软件控制的可编程的真空泵压力曲线可提高SPE方法的重现性。
实验方案一
制备校准曲线,样品稀释,使用Oasis HLB 1cc SPE小柱执行固相萃取
样品进行反相固相萃取工作流:
*注意:沃特世于1996年推出Oasis HLB, 是所有Oasis吸附剂的主要成分。可耐受pH 0-14,采用独特的水可浸润性聚合物吸附剂,省去了活化和平衡步骤,是SPE的新标杆。
以Andrew+移液机器人进行全自动SPE为例,介绍OneLab软件中的自动化方法,Andrew+将上图所示的SPE步骤自动化。
图2. 左侧为OneLab的方法创建界面,右侧为SPE工作流使用的移液枪、枪头、Dominos和Device物料清单。
Andrew+移液机器人搭载Extraction+ SPE新模块的仪器配置如下图,包括:
Andrew+ Robot主机;
微孔板抓手(自动移动96孔板);
Extraction+配套的真空泵(压力曲线受软件控制);
废液瓶(上样和清洗产生的废液,经真空泵抽取,进入废液瓶);
Extraction+配套的萃取套件(上部放置SPE小柱或萃取板,下部放置收集容器);
放置SPE小柱或萃取板的位置(左侧升降Lifter可将承载SPE小柱的架子移到左侧,以便用微孔板抓手将收集容器放入下部)。
实验结果
使用 沃特世ACQUITY UPLC I-Class液相系统搭载快速柱进行色谱分离,再用 Xevo TQ-XS串联四极杆质谱仪对从血浆中萃取出的小分子药物进行检测。分析3个浓度的血浆样品(Low QC-10 ng/mL, Mid QC-50 ng/mL, High QC-150 ng/mL),回收率范围是95.8% - 108.4%,精密度结果是几乎所有RSD%值≤5%。这些结果满足FDA对小分子生物分析方法验证的推荐限值。
表1. 回收率和重现性结果 — Andrew+执行血浆样品制备,Extraction+搭载Oasis HLB 1cc SPE小柱执行全自动SPE。
实验方案二
制备校准曲线,样品稀释,使用Oasis HLB 30mg 萃取板执行固相萃取
与实验方案一执行同样的反相固相萃取工作流,萃取耗材是Oasis HLB 30 mg plates。
实验结果
使用沃特世ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱系统搭载快速柱进行色谱分离,再用Xevo TQ-XS串联四极杆质谱仪对从血浆中萃取出的小分子药物进行检测。分析3个浓度的血浆样品(Low QC-20 ng/mL, Mid QC-50 ng/mL, High QC-400 ng/mL),回收率范围是88.6% - 110.8%,精密度结果是大多数RSD%值≤5%。这些结果满足FDA对小分子生物分析方法验证的推荐限值。
表2. 准确度和精密度结果 — Andrew+执行血浆样品制备,Extraction+搭载Oasis HLB 30 mg plates执行全自动SPE。
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