孩子生长激素缺乏？Xevo TQ-XS IVD准确定量人血清中完整胰岛素样生长因子

胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是70个氨基酸的单链多肽，分子量为7,649 Da，和胰岛素有50%的序列相同，在人体内生长激素(GH)刺激下产生。当垂体前叶分泌GH进入血液循环时，即可以在肝内促进肝脏细胞合成分泌IGF-1。如图1所示，血液循环过程中95%以上的IGF-1与胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)成结合态，约1% IGF-1以游离形式存在，发挥生理活性[1-2]。

图1. GH-IGF轴及其自分泌、旁分泌和内分泌作用的代谢图[2]。

临床意义

IGF-1介导GH的许多生理作用，刺激骨骼和其他组织的生长，并促进肌肉产生、葡萄糖和脂肪代谢等。由于GH呈脉冲式分泌且半衰期短，存在昼夜节律变化，并受运动、血糖变化等多种因素影响，而IGF-1在血液中大部分以结合态存在比较稳定，且受上述因素影响小，能很好地反应个体内源性GH分泌状态，在临床应用中发挥重要作用。IGF-1浓度水平升高，可能与肢端肥大症、特发中 枢性性早熟、肿瘤等相关；IGF-1浓度水平降低，可能与生长激素缺乏症(GHD)、糖尿病、肝硬化、营养不良等相关。

IGF-1的测定主要用于GH缺乏症的评估、治 疗检测，同时辅助GH分泌过多引起的疾病。《矮身材儿童诊疗指南》特殊检查中提出检测血清中IGF-1，可结合性别年龄和发育阶段分析是否正常，IGF-1生成试验检测GH受体功能[3]。在GHD患者的治 疗中，检测IGF-1浓度指导临床GH替代疗法剂量调整并监控IGF-1治 疗[4]。内分泌协会共识声明中建议将IGF-1水平控制在性别和年龄调整的参考范围内[5]。

当前检测方法

当前IGF-1常规检测方法为间接检测的免疫分析法，存在一定局限性，例如：实验室间不一致性、试剂批次间差异、检测存在干扰且灵敏度较低。近年来已报道采用LC-MS法直接检测IGF-1，定量准确且性能稳定，并且具有良好的一致性。但其前处理采取复杂的蛋白质酶解过程结合四极杆进行定量，或者采用亲和富集方法结合纳升级UPLC-HRMS系统分析完整IGF-1。上述方法需要消耗大量时间和资源，分析成本较高。

沃特世简单、快速的定量分析方法

沃特世开发了简单的固相萃取前处理结合三重四极杆对完整的IGF-1小分子蛋白进行定量分析(SPE-UPLC-MS/MS)的方法。样品中加入十二烷基硫酸钠(SDS)37 ℃条件下孵育以破坏IGF1-IGFBPs蛋白结合，释放IGF-1，随后加入5%乙酸乙腈沉淀大分子蛋白；离心取上清液与5%氨水混合均匀，结合96孔Oasis MAX板进行SPE萃取，采用Xevo TQ-XS IVD仪器进行检测。

实验结果

分别采用人血清和小鼠血清作为曲线基质，加标浓度范围为100 - 1,000ng/mL和5 - 1,000 ng/mL。如表1所示，经过萃取之后校准曲线的线性范围内呈线性，r2 > 0.99(1/x2加权)，定量下限(LLOQ)为5 ng/mL。采用添加浓度为10、100、750 ng/mL小鼠血清以及添加浓度为100、400、800 ng/mL的人血清制备两组低中高浓度质控，考察其精密度和准确性。

表1. 人血清本底及质控中IGF-1精密度和准确性考察。

从图2可以看出人血清和小鼠血清前处理后，色谱图中可以观察到目标物峰形良好且不存在其他干扰，实现准确定量。其中内源性血清中IGF-1含量为27 ng/mL。

图2. 小鼠血清(A)和人血清(B)2种质控经过前处理后IGF-1色谱图。

小结

本方案采用简单快速的前处理方法，96孔MAX板可同时处理96个样品，结合高灵敏度的Xevo TQ-XS IVD仪器，对人血清中完整IGF-1小分子蛋白准确定量分析。线性范围为5 - 1,000ng/mL，该方法稳定可重现(CV＜15%)，能够满足实际临床样本检测需求。

参考文献

[1]. Anders Juul . Serum levels of insulin-like growth factor I and its binding proteins in health and disease. Growth Horm IGF Res. 2003 Aug;13(4):113-70.

[2]. Jesús Argente, Julie A Chowen, Luis A Pérez-Jurado, et al.  One level up: abnormal proteolytic regulation of IGF activity plays a role in human pathophysiology. EMBO Mol Med. 2017 Oct;9(10):1338-1345. doi: 10.15252/emmm.201707950.

[3]. 中华医学会儿科学分会内分泌遗传代谢学组. 矮身材儿童诊治指南，中华儿科杂志2008年6月第46卷第6期.

[4]. Grimberg A, DiVall SA, Polychronakos C, et al. Guidelines for growth hormone and insulin-like growth factor-I treatment in children and adolescents: growth hormone deficiency, idiopathic short stature, and primary insulin-like growth factor-I deficiency. Horm Res Paediatr. 2016;86:361-397.

[5]. Clemmons DR. Consensus statement on the standardization and evaluation of growth hormone and insulin-like growth factor assays. Clin Chem. 2011;57:555-559.