【新方案】Xevo TQ Absolute高灵敏度分析二甲双胍中的亚硝胺杂质

亚硝胺杂质被视为潜在的人类致癌物或可致癌化合物。为控管药品中存在的亚硝胺，美国FDA和欧洲药品管理局(EMA)规定了药品中亚硝胺可接受的每日摄入限量（纳克/天）, 根据特定药品推荐的每日最 大剂量，使用这些限值可确定药品中亚硝胺的阈值浓度。

二甲双胍是⼀种处 方药，可用于治 疗2型糖尿病患者的⾼血糖, 有几款二甲双胍药品由于NDMA含量超过了96纳克/天的可接受摄入限值而被召回。

药品中存在亚硝胺杂质会对⼈体健康构成极大风险，必须使用高灵敏度和选择性的分析方法进行监测，并要求精度达到亚ng/mL水平。本文主要介绍使用 Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱仪配合 超高效液相色谱ACQUITY Premier系统开发的方法用于检测和定量分析⼆甲双胍药物中九种亚硝胺杂质(NDMA、NDEA、NEIPA、NMOR、NDIPA、NDPA、NMPA、NMBA、 NDBA)的性能。

图1. Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱仪配合超高效液相色谱ACQUITY Premier系统。

实验分析

01、样品制备

• 将每种亚硝胺各5.0 - 10 mg/mL的单标储备液溶于甲醇中，制备含九种亚硝胺(100 μg/mL)的混标溶液。用水连续稀释混标溶液，制备LOD、LOQ和线性标准溶液。

• 用水制备浓度为20 mg/mL的⼆甲双胍药物样品溶液，然后用0.2 μm/mL的 PVDF针头式过滤器(P/N: WAT200806)进行过滤以备分析。

02、液相色谱条件

• 液相色谱系统： ACQUITY Premier系统

• 检测条件： MS/MS

• 样品瓶： LCMS最 大回收样品瓶，容积2 mL，P/N: 600000670CV

• 色谱柱： Atlantis Premier BEH C18 AX (2.1 x 100, 1.7 μm)，P/N: 186009368

• 流动相A： 含0.1%甲酸和5 mM甲酸铵的水溶液

• 流动相B： 含0.1%甲酸和5 mM甲酸铵的甲醇溶液

03、质谱条件

• 质谱系统：Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱仪

• 电离模式：APCI+

• 采集：MRM模式，如表1所述。

• 表1. 使用Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱仪的MRM通道设置，所有亚硝胺的采集均设置为13点/峰和Auto Dwell（自动驻留）。

04、数据管理

• 仪器控制：MassLynx v4.2

• 数据处理：TargetLynx

05、结果与讨论

• 纯溶剂中的定量分析

  该UPLC-MS/MS方法所能达到的亚硝胺LOD和LOQ分别是按照3:1和10:1的信噪比(S/N)标准确定的。纯溶剂中LOQ溶液的代表性色谱图如图1所示。表2总结了方法的性能特征，包括LOD、LOQ和线性。LOQ对于20 mg/mL⼆甲双胍药物来说相当于0.005和0.0005 ppm。根据六次重复进样的数据（表2），峰面积的相对标准偏差(RSD)低于10%，证明该方法在检测亚硝胺的LOQ方面性能优异，此外，本该方法显示了MS响应和浓度之间的线性关系，相关系数≥0.996（表2）。

图2. 用纯溶剂（水）制备的亚硝胺标准溶液（LOQ水平）的代表性色谱图，使用Xevo TQ Absolute在MRM模式下采集，S/N为PtP（峰到峰）。

表2. 使用Xevo TQ Absolute在MRM模式下分析纯溶剂中亚硝胺的方法性能。* 相对于20 mg/mL⼆甲双胍的LOQ(ppm)。

⼆甲双胍药物中的定量分析

在MRM采集模式下分析20 mg/mL的⼆甲双胍药物水溶液，检测其中存在的亚硝胺。该方法可以准确测量⾼浓度⼆甲双胍供试品中的亚硝胺杂质。分析⼆甲双胍药物和加标后⼆甲双胍药物样品中亚硝胺(NDMA、NDEA、NMOR和NEIPA)的代表性色谱图如图3所示。⼆甲双胍加标样品中亚硝胺的MS响应和S/N与纯标准溶液中的值相当，表明高浓度⼆甲双胍峰没有离子 抑 制作用。图3为分析20 mg/mL⼆甲双胍药物(DS)和加标后⼆甲双胍供试品中亚硝胺的代表性色谱图。使用TargetLynx软件，通过对比计算浓度和已知的加标浓度计算出百分比回收率。用⼆甲双胍药物制备的校准标样计算亚硝胺的回收率。⼆甲双胍药物中亚硝胺标准品的标准曲线显示MS响应与浓度呈线性关系，R2≥0.999（图4）。该方法对二甲双胍药物中的所有亚硝胺均表现出优异的准确度（表3）。对于NDMA，0.1 ng/mL和1 ng/mL时的回收率分别为89 - 98%和93 - 98%；对于其他杂质，0.025 ng/mL（或0.00125 ppm，相对于20 mg/mL⼆甲双胍药物）时的回收率为85 - 110%，5个样品的RSD ≤ 6.50%。

图3. 分析20 mg/mL⼆甲双胍药物(DS)和加标后⼆甲双胍供试品中亚硝胺的代表性色谱图。

图4. 用⼆甲双胍药物制备的亚硝胺标准品的标准曲线(NDMA:0.1 - 10 ng/mL，其他杂质：0.025 - 10 ng/mL）。

表3. 方法准确度：以不同浓度加标到20 mg /mL时⼆甲双胍药物中亚硝胺的回收率（样品n = 5）。

结论

本研究利用Xevo TQ Absolute质谱仪和ACQUITY Premier系统开发了⼀种高灵敏度方法，能够对⼆甲双胍药物中的亚硝胺进行超微量检测和定量分析。使用Atlantis Premier BEH C18 AX色谱柱完成出色的色谱分离。该方法显示出优异的定量性能，在纯溶剂和20 mg/mL⼆甲双胍药物中的LOQ分别达到0.01 - 0.1 ng/mL和0.025 - 0.1ng/mL。⼆甲双胍药物中亚硝胺的线性和准确度结果分别为R2 ≥ 0.999、回收率为85 - 110%。

本文所述的UPLC-MS/MS方法可对⼆甲双胍药物中的亚硝胺进行高灵敏度、高专属性和准确的分析，达到准确监测残留亚硝胺的目的，这对于产品质量和安全至关重要。