如何通过流式细胞术鉴别细菌和病毒感染？

抗生素的过度使用会导致人类细菌感染对抗生素的耐药性增加，已成为目前全 球十大公共卫生威胁之一。根据世界卫生组织（世卫组织）最 新报告显示，根据87个国家在2020年报告的数据，常见细菌感染对治 疗的耐受性越来越强，导致致命血流感染的细菌耐药性很高，并且造成社区常见感染的几种细菌对治 疗的耐受性也在增加。由于临床上很难及时有效地区分细菌和病毒感染，可能是导致抗生素过度使用的原因之一。

目前临床上检测感染类型的方法有很多，以下是一些常见的方法：

症状和体征：

虽然某些症状和体征可能与细菌和病毒感染都有关，但一些症状和体征可能更常见于特定类型的感染。例如，喉咙痛和咳嗽可能是细菌感染的迹象，而流鼻涕和打喷嚏可能是病毒感染的迹象。

细菌和病毒检测：

医生可以通过分析患者的血液、尿液或其他生物体液样本来检测细菌或病毒的存在。细菌感染可以通过培养细菌并观察其在培养基上的生长来检测，而病毒感染通常需要使用特殊的检测方法，例如PCR（聚合酶链式反应）。

白细胞计数：

细菌感染通常导致白细胞计数升高，而病毒感染则不一定如此。

C反应蛋白（CRP）和其他生化指标：

在细菌感染中，CRP和某些细胞因子等其他生化指标通常会升高，而在病毒感染中，它们通常会保持正常水平或轻微升高。

这些方法可以帮助临床医生在一定程度上区分细菌感染和病毒感染，但在灵敏度、特异性、操作便捷性和报告及时性仍存在一定的挑战，因此研究者们也一直在寻找更及时有效的检测方法，这一次，研究者们把目光聚焦在对机体对感染的免疫应答上！免疫系统作为机体对抗外来病原体的重要防线，会对感染做出及时响应，通过观察免疫细胞在感染中的免疫应答是否也可以及时有效地区分细菌和病毒感染？

先天免疫系统是免疫应答的第 一道防线，髓系细胞，如粒细胞、单核细胞、NK细胞、DC，有助于先天免疫系统识别入侵的病原体和组织损伤。这些细胞在与微生物和损伤模式（PAMP、DAMP）接触时被激活，引发强烈的炎症反应，并释放各种促炎介质，如细胞因子、干扰素（IFN）和特异性细胞标志物。这是由先天免疫系统提供的对感染的即时反应。研究表明当机体受到细菌或病毒攻击时，先天免疫系统的髓样细胞会做出不同的反应1。在机体受到炎症刺激、自身免疫疾病、细菌或病毒感染后激活干扰素（I型和II型）信号传导，I型和II型干扰素（IFN）是调节免疫反应的核心参与者，I型IFN介导病毒性免疫应答，II型IFN介导细菌性免疫应答。因此，髓系细胞活化指标是感染早期检测的理想标志。

图1病毒和细菌感染的特异性干扰素应答；I型IFN（IFNα、IFNβ）：病毒感染；II型IFN（IFNγ）：细菌感染

CD169、CD64和HLA-DR是中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞等髓样细胞表达的活化标志物，它们在感染检测和免疫功能评估中具有重要作用。

CD169，也称为Siglec-1，是一种膜上糖蛋白，属于蛋白质家族Siglec。CD169主要表达在树突状细胞和巨噬细胞的表面，并与细胞外病毒颗粒的糖基结构特异性结合，促进病毒的吞噬和清除。因此，CD169在感染检测中具有重要作用。研究表明，病毒感染后，CD169的表达水平会上调，这表明CD169可能是一种早期的病毒感染指标。在肝炎病毒和爱滋病毒感染中，CD169的表达与病毒的传播和清除有关。因此，检测CD169在病毒感染中的表达水平可以帮助了解病毒感染的程度和病情。

图2 CD169+髓细胞对先天免疫和适应性免疫不同细胞亚群的潜在影响2。CD169+的表达是由病毒感染后的I型IFN信号诱导，启动下游IFN途径，促进病毒滴度控制和适应性免疫细胞启动和募集。

有研究显示，外周血单核细胞CD169的检测可以作为COVID-19高敏及快速筛查的方法3。

图3 根据疾病分期和SARS-CoV-2 RT-PCR结果，与健康献血者相比，新冠肺炎患者单核细胞CD169的表达3。方框图A-C总结了健康献血者（HBD，n=25，绿点）与新冠肺炎患者早期（A，黑点）、晚期（B，蓝点）或无症状（C，红点）的CD169指数水平（单核细胞与淋巴细胞信号的比率）与RT-PCR结果的比较；蓝线表示阳性阈值（3.5）。图D计算每组的ROC曲线，然后计算3.5阈值下的灵敏度、特异性、PPV(positive predictive value)和NPV（negative predictive value）。

CD64是一种Fcγ受体，也称为FcγRI。CD64主要表达在单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的表面，可以结合抗体的Fc部分，并在体内介导胞吞作用和抗体介导的细胞毒作用。CD64的表达水平可以反映细菌或真菌感染的严重程度，CD64感染指数是一种用于评估感染严重程度的生物标志物。在临床上，CD64感染指数已被广泛应用于评估感染的早期诊断、疾病监测和预后评估4。通过流式细胞术检测CD169与CD64的表达可以帮助急诊科对感染类型的鉴别进行临床研究评估5。

图4 三组不同患者nCD64和mCD169的表达差异5。图A 第 一组（无感染）、第二组（细菌感染）和第三组（病毒感染）中性粒细胞上CD64的表达。图B 对于相同的三组，CD169在单核细胞上的表达。数据以平均误差和标准误差表示。使用t检验计算各组之间的p值，如果p≤0.05，则显示显著差异。MFI表示平均荧光强度。

HLA-DR是人类白细胞抗原中的一种MHC II分子，主要在抗原呈递细胞（如树突状细胞、巨噬细胞、）表面表达，参与调节T细胞免疫应答。在感染疾病中，HLA-DR的表达水平可以发生变化6-7，主要表现为以下两种情况：

增加：

HLA-DR的表达增加通常发生在早期感染阶段，是机体对感染的一种免疫反应。感染时，免疫细胞受到刺激后会释放促炎性因子，这些因子会刺激抗原呈递细胞表达HLA-DR，从而引发T细胞免疫应答。HLA-DR的增加也可以作为评估感染早期诊断和严重程度的生物标志物。

降低：

HLA-DR的表达降低则常常发生在感染的晚期阶段，是机体免疫功能的抑 制反应。在感染后的几天或几周，免疫细胞受到长期的刺激和激活，容易导致抗原呈递细胞功能异常和免疫耗竭。这时，HLA-DR的表达通常会下降，表明机体的免疫反应受到了抑 制。HLA-DR的降低也可以作为评估感染后免疫抑 制状态的生物标志物。

为了帮助研究者更及时有效地对感染早期的免疫应答进行评估，从而帮助鉴别细菌和病毒感染，贝克曼库尔特也推出了一款3色的髓系活化检测试抗体组合(货号C63854)*用于外周血的髓系活化标志物进行检测。

该试剂方案无需进行补偿操作，支持免洗检测，检测过程便捷高效一步到位。

除了可用帮助区分细菌感染和病毒感染之外，还于以下领域的研究：

抗生素耐药性：

感染源和感染性质识别错误问题严重，易导致抗生素滥用和机体耐药性8。利用nCD64快速识别细菌感染，将有助于生物标志物的研究和新抗生素的开发9。

病毒性疾病进展：

髓系细胞活化标志物（CD169）已广泛应用于病毒性疾病的进展监测和病毒清除，如HIV和肺部病毒感染，包括COVID-19 10-13。

干扰素信号传导：

干扰素是一类细胞因子介质，在感染时向细胞免疫系统报警。I型和II型干扰素对髓样细胞的作用取决于炎症刺激程度13-14。

自身免疫性炎症性疾病：

研究表明，在RA、SLE、干燥综合征等系统性自身免疫性疾病出现的慢性炎症中，干扰素介导的信号传导发挥免疫调节等重要作用15。

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 ● 参考文献： 

1.Bourgoin P, Biéchelé G, Ait Belkacem I, Morange PE, Malergue F. Role of the interferons in CD64 and CD169 expressions in whole blood: Relevance in the balance between viral- or bacterial-oriented immune responses. Immun Inflamm Dis. 2020;8(1):106-123.

2.Herzog S, Fragkou PC, Arneth BM, Mkhlof S, Skevaki C. Myeloid CD169/Siglec1: An immunoregulatory biomarker in viral disease. Frontiers in Medicine. 2022;9.

3.Michel M, Malergue F, Belkacem IA, Bourgoin P, Morange PE, Arnoux I, Miloud T, Million M, Tissot-Dupont H, Mege JL, Busnel JM. An ultra-sensitive, ultra-fast whole blood monocyte CD169 assay for COVID-19 screening. medRxiv. 2020 Oct 26:2020-10.

4.Ajmani S, Agarwal V, Gurjar M. State of Globe: Neutrophil CD64: Is It a Reliable Biomarker for Sepsis? J Glob Infect Dis. 2018 Apr-Jun;10(2):33-34.

5.Bourgoin P, Soliveres T, Ahriz D, Arnoux I, Meisel C, Unterwalder N, Morange PE, Michelet P, Malergue F, Markarian T. Clinical research assessment by flow cytometry of biomarkers for infectious stratification in an Emergency Department. Biomarkers in Medicine. 2019 Nov;13(16):1373-86.

6.Juskewitch, J.E., Abraham, R.S., League, S.C., Jenkins, S.M., Smith, C.Y., Enders, F.T., Grebe, S.K., Carey, W.A. and Huskins, W.C.,  Monocyte HLA-DR expression and neutrophil CD64 expression as biomarkers of infection in critically ill neonates and infants. Pediatric research,2015; 78(6), pp.683-690.

7.Gatti, A., Fassini, P., Mazzone, A., Rusconi, S., Brando, B. and Mistraletti, G., Kinetics of CD169, HLA-DR, and CD64 expression as predictive biomarkers of SARS-CoV2 outcome. Journal of Anesthesia, Analgesia and Critical Care, 2023;3(1), pp.1-10.

8.Shallcross LJ, Davies DS. Antibiotic overuse: a key driver of antimicrobial resistance. Br J Gen Pract. 2014 Dec;64(629):604-5.

9.Ajmani S, Agarwal V, Gurjar M. State of Globe: Neutrophil CD64: Is It a Reliable Biomarker for Sepsis? J Glob Infect Dis. 2018 Apr-Jun;10(2):33-34.

10.Akiyama H, Ramirez NP, Gibson G, et al. Interferon-Inducible CD169/Siglec1 Attenuates Anti-HIV-1 Effects of Alpha Interferon. J Virol. 2017;91(21):e00972-17.

11.Stegelmeier AA, van Vloten JP, Mould RC, Klafuric EM, Minott JA, Wootton SK, Bridle BW, Karimi K. Myeloid Cells during Viral Infections and Inflammation. Viruses. 2019 Feb 19;11(2):168.

12.Bedin AS et al. Monocyte CD169 expression as a biomarker in the early diagnosis of COVID-19, medRxiv 2020.06.28.20141556.

13.Park MD. Macrophages: a Trojan horse in COVID-19? Nat Rev Immunol. 2020 Jun;20(6):351.

14.Hadjadj J, Yatim N, Barnabei L, et al. Impaired type I interferon activity and inflammatory responses in severe COVID-19 patients. Science. 2020;369(6504):718-724.

15.Rose T, Szelinski F, Lisney A, et al. SIGLEC1 is a biomarker of disease activity and indicates extraglandular manifestation in primary Sjögren's syndrome. RMD Open. 2016;2(2):e000292.