《临床实验室》杂志刊登丹纳赫集团人类致病性病毒污水监测文章

近日《临床实验室》杂志刊登丹纳赫集团《人类致病性病毒的污水监测方法与传染性疾病的爆发预警和流行趋势预测》文章，丹纳赫集团/贝克曼库尔特产品专员余启昆为第 一作者，丹纳赫集团/赛沛中国首席医学官汤一苇和加拿大阿尔伯塔大学庞晓莉教授为共同通讯作者。随着全 球人口城市化及流动加剧，新发性传染病在全 球范围内流行造成巨大的社会和经济负担。污水是一种包含多种生物和化学标志物重要信息来源。污水监测可用于传染病爆发提前预警，监控疾病爆发趋势及动态变化，作为一种重要的独立、互补的方法学越来越多被世界各国所关注。特别是新冠爆发以来，通过污水监控可以获得社区乃至社会层面的爆发信息，这对于其防控及预警至关重要。在应对临床前或无症状感染者时，污水监测相较于临床检测优势显著。文章从多个维度系统性从污水监测概念、优势、监测人类病毒类型、污水样本特点、采样分布及富集检测等诸多方面进行综述及讨论。污水中病毒颗粒含量极低且成分复杂，需要搭配高回收率病毒富集方式和高灵敏度检测手段，从而使其在疾病爆发预警及流行趋势监测成为可能。

污水监测 (wastewater surveillance)的基本原理是基于特定微生物病原体的排泄模式，受感染个体会在长达数周时间内通过粪便排出病毒，无论他们是否有临床症状。例如，大多数感染新冠病毒或者肠道病毒的人在出现症状之前和之后会从粪便中排出大量病毒。病毒通常会从血液、唾液、分泌物、粪便和尿液等体液中渗入污水。传染病爆发早期预警对于阻止其传播至关重要，而基于污水监测的污水流行病学(Wastewater-based epidemiology)是一门很有前途的全人群传染病监测的新兴学科，它能够监测污水中不同类型传染源存在、预警疾病爆发。它充分考虑了有症状和无症状患者，不仅可以提供有关确诊病例活动的信息，而且还可用于衡量疾病的流行情况。而传统传染病监控手段以被动监测（passive surveillance）为主，这种监测有一个严重的缺陷，即不能包括未到医疗机构就诊的病人。而在本次新冠时期所采取的主动监测（active surveillance）过度依赖于点对点筛查如临床症状等，这些方法虽然具有高灵敏度和特异性，但在应对大规模人群筛查，该方法不仅费时费力，而且经济上实现难度较大，当遇到临床检测能力不足或者不可用时，情况将变得尤为挑战。甚至其中许多病毒会导致无症状感染/排毒，这也增加了点对点筛查难度，使得流行情况难以估计。因此，开发一种经济、高效、灵活、独立且能够与现有方法强 力互补的监测手段尤为重要。基于污水监测病毒流行的方法越来越受到重视，主要原因在于该方法可覆盖大量人群，为相关疫情爆发提供预警信号、监控疫情动态发展变化及评估干预后的效果等。

污水监测概述

污水作为一种包含多种生物和化学标志物重要信息来源，对污水的研究历史由来已久，早期主要集中在分析化学品、外源性污染物等，分析的主要重 点通常是确定进入污水处理过程的药物浓度，监测废水处理过程的去除效率等。基于污水可用于分析违禁药物（如甲基 苯 丙胺、海 洛因、大 麻、氯 胺酮等）、合法药物（咖啡 因、酒精、烟草）、个人护理产品（苯二氮卓类药物、抗抑郁药、抗生素]和其他抗微生物制剂）及工业化学品（杀虫剂、增塑剂）的使用情况，相关化学标志物已经得到了广泛的研究。研究学者将污水中这些化学标志物浓度与人口规模使用、消耗或接触率联系起来，进而可以提供关于特定污水流域内居民活动重要定性或定量信息。

在病原体领域，污水监测可监测病原体如细菌、病毒、真菌和原生动物病原体等，也可用于追踪或监测特定社区内传染性病原体的传播趋势。在多重耐药菌方面，污水代表了人类相关菌群的复合体，如病原体、抗生素耐药细菌 (ARB) 和抗生素抗性基因 (ARG)等。通过污水监测特定社区可确定抗生素耐药性的基本水平，为抗生素合理使用和抗生素污水处理提供宝贵参考信息及评估干预措施的效果。污水监测更可用于选定人群，这些人群被怀疑存在相应的监测缺陷，且存在使人群面临对应病毒传播风险……

基于污水监测人类病毒

能够感染人类的病毒非常多，为了便于叙述，根据其传播途径，我们简单划分为粪-口传播类型病毒、呼吸道/接触传播病毒及虫媒传播病毒。各种通过粪口传播的病毒，如诺如病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒、爱知病毒、星状病毒、轮状病毒、甲型和戊型肝炎病毒等。这些病毒可引起散发病例或广泛性暴发，从轻微到严重的胃肠炎到脑膜炎、呼吸系统疾病、结膜炎、瘫痪或肝炎等。呼吸道/接触传播病毒以新冠为例，新冠爆发以来中国香港及世界各国大多都启动了污水监测相关研究。据相关数据统计，新冠在全 球范围内造成了近6.83亿例感染，近680万人死亡（https://www. worldometers.info/coronavirus）。由于人类病毒感染者会在粪便或分泌物中释放病毒核酸，这就为污水监测提供了先决条件 ……

图1. 基于污水监测病毒传播

污水样本的特点和采样分布

基于污水监测，可简单将其划分成5部分：分别为采样、浓缩富集、提取、检测及数据解读。由于污水样品基质极其复杂，病毒含量较低(特别是在社区暴发初期)，因此从环境样品中取样、浓缩富集、提取和检测极具挑战……

污水浓缩富集方法

低浓度病毒核酸在复杂成分的污水中，需要高效率和高回收率的处理方法，这对于污水监测预警极其重要。低回收率可能会导致假阴性，高效的病毒污水浓缩富集方法能有效去除污水中干扰杂质，得到高纯度病毒，对于后续检测至关重要。对病毒样本进一步测序和系统发育分析也有助于了解感染源和传播动态。在评估回收效率时，由于不同样本差异极大，通常通过添加外源性内参替代病毒（surrogate viruses），从而可以更好校正及评估回收率。高效浓缩富集样品时，尽可能去除对下游检测干扰的杂质显得尤为重要，不同来源污水的基质成分差异极大，其对富集效率潜在影响较大。对于污水早期预警，浓缩富集方法应尽可能灵敏、高效、快速。常用的病毒浓缩方法包括聚乙二醇（PEG）沉淀法、超速离心、超滤、负电性膜（EM）吸附等……

污水病毒检测方法概述

污水可以成为监测人群中病毒传播最有价值信息源。传统污水样品病毒检测方法如细胞培养或电子显微镜，这些方法耗时、繁琐，通常需要高水平专业技术人员。相比之下，分子生物学方法已经彻底改变了污水中病毒检测状况，让我们对各种病毒进行快速和灵敏的检测成为可能。最常用的方法包括：实时荧光定量PCR（qPCR）、数字PCR（dPCR）、环介导等温扩增（LAMP）、二代测序（NGS）及Cepheid Xpert病原核酸检测试剂盒等（表3）。如下是这些方法在污水样品中直接检测病毒的详细介绍……

质量控制

分子检测技术已被广泛地用于定量检测各种污水样本中致病性病毒DNA/RNA水平，作为社区中病毒感染的监测指标，也可以用于特定群体（如学校、养老院）感染爆发的早期预警，防止疾病的传播。但目前，各监测机构之间的结果和数据往往不能分享和比较，这主要是因为目前还没有标准化的检测流程或商品化检测产品；因此，污水监测过程的质量控制就变得尤为重要。

据相关报道，污水中的蛋白质、脂肪、碳水化合物、多酚、金属离子和RNA 酶可能会抑 制或降低PCR反应的灵敏度，可能导致假阴性结果。为了确保污水中病毒检测的准确性和可靠性，分子检测方法需要进行质量控制。其中一个重要的方面是对每个实验批次进行阳性对照和阴性对照。阳性对照应该包括已知数量的病毒DNA或RNA，以评估检测效率和准确性。阴性对照应该包括与目标病毒无关的样本，以评估检测的污染和假阳性。此外，在检测中加入内参，例如内源性或外源性内参，以评估提取和扩增效率以及检测中的潜在抑 制物……   

结果解读及展望

解读污水中病毒监测结果需要考虑多个因素。我们需要将污水中病毒的分子检测结果与其他流行病学监测数据相结合，例如临床病例、疫情地图、人口流动等，以便全面评估当前的疫情形势和风险。特别是对于一些高传染性和致命性的病毒，例如新冠病毒，可以通过污水监测提前预警，发现潜在感染者，采取及时有效的防控措施，从而有效地遏制疫情的蔓延……

针对于特定区域下水道或污水处理厂，通过污水监测可以为某一区域或城市疾病爆发提前预警。污水监测可补充临床检测的局限性，不仅可以阐明目标病原真实的感染情况，而且可以为疾病的爆发进行预警。污水监测的另一个重要作用在于它可以通过系统发育分析检测病毒株的变异，为追踪病毒随着时间和不同区域变异情况提供了宝贵信息。污水监测还可以跟踪污水中病毒浓度的季节性波动，反映社区中的病毒流行病学模式。不仅如此，不同区域间污水的比较甚至可以深入了解导致疾病爆发的环境、社会经济因素和疾病模式等。

污水监测可以作为一个早期指标，表明社区中病毒感染者数量正在增加或减少。衡量公共卫生干预措施的效果，研究人员可以看到污水病毒信号是否在接种疫苗或学校停课等干预措施后增加或减少，通过污水处理厂取样来监测城市更大人群病例是在上升还是下降。污水监测可以为未来的大流行预测创建预警响应机制，它是提供城市人群健康状况和传染病发展趋势的重要信息来源。在未来，相信基于污水监测开发的强大健康监测系统将会发挥越来越重要的作用，它是有效和及时预防控制新发性、季节性乃至应对未来传染病的重要武器。