两位技术大咖共同探讨 CRISPR 的广泛用途

CRISPR 在微生物组工程科学突破中的作用

CRISPR 首次在海洋细菌的基因组中发现，当面临病毒威胁时，细菌细胞通过捕获和复制病毒的 DNA 片段来产生免疫反应，这使得细菌能够识别随后的攻击并切割病毒 DNA 以阻止病毒感染。另外，还发现 Cas 酶负责切割 DNA，这种防御机制后来被 Doudna 和 Charpentier 利用，他们可以靶向目标 DNA 序列，并使用 CRISPR-Cas9 系统将其分离[1]。

在过去的十年中，CRISPR-Cas9 已被证明在药物发现和药物制造中具有巨大的价值。使用合成向导 RNA（gRNA），科学家可以靶向目标 DNA 序列并使用 Cas9 进行切割。随后，宿主修复机制试图通过非同源末端连接（NHEJ）修复 DNA，导致改变基因功能的随机突变。利用这种机制，科学家们现在可以使基因沉默来阐明它们在疾病表型中的作用，这有利于发现目标。此外，科学家还可以利用 CRISPR-Cas9，通过识别与免疫系统逃避相关的一组基因来揭示耐药机制。

然而，今天，我们将探索 CRISPR 的不同应用：微生物组工程。本期内容我们来讨论 CRISPR 在微生物组工程中的应用以及它如何克服人类微生物组研究的瓶颈。

本次嘉宾

SNIPR Biome 副总裁兼交付技术主管 Jakob Haaber 博士和 Infinome Biosciences 联合创始人、CEO 兼 CTO Richard Fox 博士一起探讨 CRISPR 的广泛用途，包括治 疗和生物制造。

CRISPR-Cas9 如何帮助探索人类微生物组在疾病中的作用

众所周知，人体含有数万亿种微生物，在数量上超过了人体细胞。这些微生物统称为微生物组，通过调节细胞外环境和保护细胞免受病原体侵害，与人体形成共生关系。因此，从糖尿病、肥胖到癌症，微生物组的破坏与许多疾病密切相关也就不足为奇了。

通过设计 CRISPR-Cas9 系统来切割特定的细菌 DNA 序列以消除致病细菌，这种特异性使 CRISPR 技术减轻对整体微生物组的破坏，实现药物发现进程的加速。SNIPR Biome 是积极 致力于实现这一目标的公司之一，SNIPR Biome 副总裁兼 CRISPR 负责人和交付技术主管 Jakob Haaber 博士描述了 CRISPR 在致病性大肠杆菌消除中的应用：“我们使用 CRISPR 杀死大肠杆菌。目前，治 疗细菌感染最常用的就是抗生素。但抗生素耐药性的发生率增加，进而使抗生素无效。CRISPR 的优点是它不区分抗生素敏感和抗生素耐药细菌。”他还建议，CRISPR 可以专门针对致病细菌，而不影响健康肠道微生物组中不可或缺的有益细菌，而不是像抗生素一样，对健康细菌和病原体都有影响。

CRISPR 的优势和近年发展

Infinome Biosciences 的联合创始人、CEO 兼 CTO Richard Fox 表示，CRISPR 的主要优势在于其扩大基因组编辑的能力。“我们现在可以精确地编辑整个通路或基因组，而不是一小部分目标基因上的随机突变，从而引入数十万个变化。”

大规模的基因组编辑产生可商用的细胞库，研究人员可以将其整合到高通量表型筛选中。这些库消除了手动敲除大量基因进行表型分析的需要，并为加速药物发现研究提出了解决方案。

CRISPR 技术的另一个优点是提高了特异性，微生物组基因编辑是受益于特异性的领域之一。CRISPR 系统可以被编程为切割特定的细菌 DNA，甚至在不杀死细胞的情况下去除细菌细胞壁内的基因回路。综上所述，这些进步推动了肠道微生物群偏差的新基因疗法。

与此同时，CRISPR 系统已经能够制造出更小的基因构建体，以便更容易地装配到递送载体中。因此，除了 CRISPR 之外，递送载体还可以携带多种成分，构成一种多功能的基于基因的疗法，不仅仅是切割或插入 DNA。

加速 CRISPR 技术的制造

合成生物学和生物工程之间的差距通常是由时间和成本问题引起的。将生物制造解决方案推向市场需要大型实体，这些实体具有完善的基础设施、强大的自动化、大量的人员、仪器、信息学和大量资金。因此，生物制剂的开发可能需要 5-10 年和数百万美元也就不足为奇了。这是一项风险相当大的投资，因此制药公司往往不愿参与其中，从而一些具有巨大治 疗潜力的领域未得到开发。

支持 CRISPR 的基因组编辑系统的设置是工作流程的瓶颈之一。大规模基因组工程系统的设计非常费力，因为需要产生微量的供体序列来靶向并精确地将 10,000 个位点编辑到整个基因组。

Infinome Biosciences 的联合创始人之一 Andrew Garst 提出了一项关键创新，将指导切割的引导序列与介导修复的供体序列配对，从而将广基因组编辑减少到只需点击几下。Richard Fox 认为，“这种自动化设计和构建系统可以在不到一周的时间内创建编辑过的细胞库，这是过去所花费努力的一小部分。”

微生物基因编辑步骤

肠道微生物组基因编辑的第 一步是 CRISPR 系统的体外验证。CRISPR 编辑的特异性是针对一组代表肠道微生物组的细菌进行测试的，以确保 CRISPR 系统针对预定的细菌亚种，并且使得有益细菌不受 CRISPR 诱导的基因编辑的影响。

然后，验证继续进行到临床前和临床研究。利用基因组测序技术，研究人员证明基因编辑不会以有害的方式扰乱微生物组。当然，脱靶效应不可避免地会发生，正如全基因组测序所揭示的那样。我们需要做的是监测发生率，并确保这些影响是微不足道的，不会干扰基因编辑。

测序和表型分析揭示了基因组携带的一组编辑以及细菌种群中的主要菌株。为了进一步验证靶向基因组编辑的成功，可以将细菌种群置于环境压力源中并监测其行为。这确保了基因编辑赋予细菌所需的特性，例如在缺氧等环境压力下生长的能力。

通过加速的 CRISPR 工作流程，研究人员可以在数十万个基因敲除中得到一组有益的基因编辑。

CRISPR 系统还可以根据特定的研究需求，灵活地富集或消耗相同的细菌菌株。例如，Infinome 的研究人员应用 CRISPR 来设计大肠杆菌菌株，以扩大赖氨酸的生产，赖氨酸是一种用作食品添加剂的关键氨基酸。另一方面，SNIPR 使用相同的系统从血液癌患者的肠道中根除有害的大肠杆菌菌株，以防止血液感染。

展望

如前所述，CRISPR 能够对抗致病菌，已多次证明，传统的抗生素治疗通过作用有害和有益细菌来破坏肠道微生物群。CRISPR 可以帮助增强细菌的特异性，以维持人类肠道微生物群的平衡。

另一个令人兴奋的前景是设计具有治疗潜力的细菌菌株的能力。这可用于通过工程细菌为微生物组添加遗传功能，这些细菌可以表达身体以前缺乏的特定酶或代谢物。

最 后，CRISPR 在生物医学和生物工业工程中的成功应用依赖于进行组合编辑的能力，也称为“DNA 洗牌”。特别是在大型微生物系统中，引入多次编辑以减少筛选轮次的能力对于生物工业生产至关重要。

Molecular Devices 通过提供前沿技术来帮助科学家加速 CRISPR-Cas9 基因组编辑的近期目标。准确的文库筛选和 CRISPR 编辑命中物的选择是微生物组工程工作流程的关键，使生物制造产品更快地推向市场。