在反兴奋剂控制中使用 AssayMAP Bravo 样品制备平台进行半自动化 GC/Q-TOF 筛查

体育运动中的兴奋剂是指对国际体育组织规定的禁用物质和禁用方法的统称。即除一般物质外，也包括禁用方法和其它生理物质，例如血液、尿液和含有违禁药物成分的食品添加剂、营养补品、饮料等，只要这些生理物质以“非正常量或通过不正常途径”摄入人体，均被视为兴奋剂。再比如用血液回输以增强体内红细胞值的方法、尿液输入膀胱以逃避检测的方法，都属于使用兴奋剂。以及一些食品、饮品、补品中含有某种禁止使用且超出限制量的化学成分，也是兴奋剂。

来源：百度百科

为了保持世界反兴奋剂机构（WADA）的认证，各兴奋剂检测实验室不断努力提高分析方法的灵敏度、选择性、重现性以及定量能力。不止如此，其对能够随时进行回顾性分析的可靠筛查方法的需求也在不断增加^[1]。

GC/MS 作为兴奋剂检测领域的一种重要工具，与 LC/MS 技术互补，可检测尿样中需进行筛查的约600种化合物中的400多种。

据 WADA 的统计数据显示，在过去几十年中，AAS 一直是检出最多的兴奋剂之一（约占所有检出物的 50%）。且在近几年发现了几种 AAS 的“长期代谢物”。这些代谢物需要耗费更长的时间排出体外，并且浓度往往低于传统代谢物。硫酸化在这些长期代谢物的形成过程中起着重要作用，并且直到最近，LC/MS/MS 仍被认为是检测 AAS 硫酸化代谢物的唯 一技术。然而近期，已有全新研究证明，通过在热进样器中裂解硫酸基团，可以使用 GC/MS 检测这些硫酸化代谢物[2,3]。与只能检测硫酸基团丢失的 LC/MS/MS 相比，GC/MS 可以提供更高的分离能力和更多的结构信息。

采用 GC/MS 方法的挑战在于样品前处理，可以使用乙酸乙酯液液萃取法（LLE）或固相萃取法（SPE）进行样品前处理。SPE 具有更高的萃取回收率，以及相应的冲洗程序，可以获得更洁净的提取物。此外，SPE 更适合自动化。基于多种需求，Agilent AssayMAP Bravo 系统已成为用于 SPE 自动化样品前处理的强大平台。AssayMAP Bravo 是一种微量色谱系统，可使用具有各种表面化学键合相的填充树脂床小柱平行处理 1-96 个样品。虽然 AssayMAP Bravo 系统通常被用作蛋白质样品前处理平台，但本研究表明，与 LLE 方法相比，该系统不仅对硫酸化代谢物具有明显更高的萃取回收率，对于其他几乎所有极性化合物也同样如此。借助小型化流程，减少了废弃物，进而减少了对环境的影响。由此，我们提出了一种使用 GC/TQ、GC/Q-TOF 和 AssayMAP Bravo 样品前处理平台的统一方法，帮助分析人员在兴奋剂检测应用中实现高效筛查并获得可靠结果。

图 1. AssayMAP Bravo 样品前处理平台

实验部分

样品

样品包括使用去除类固醇的尿样配制的 6 个校准品（绘制用于分析内源性类固醇的校准曲线）、使用去除类固醇的尿样配制的 4 种不同浓度水平的 4 个质控（QC）样品、1 个空白水样、1 个阴性对照尿样和 84 个真实尿样。

水解

在 96 孔板中进行样品前处理。向 0.5 mL 尿样中加入氘代内标（IS）混合物，并与大肠杆菌 β- 葡萄糖醛酸酶在 pH 7 的磷酸盐缓冲液中于 56 °C 孵育至少 1 小时。

借助 AssayMAP Bravo 样品前处理平台，

使用自动化 SPE 进行样品萃取

在 AssayMAP Bravo 上使用改良版的多肽净化应用程序，通过 Agilent AssayMAP 25 µL 反相（RP-S）小柱（货号 G5496- 60023）进行自动化 SPE（图 1）。使用 250 µL 甲醇，以 300 µL/min 的流速灌注 RPS 小柱，然后用 100 µL 20% 甲醇以 25 µL/min 的流速进行平衡。将 1 mL 样品以 25 µL/min 的流速上样至该小柱。然后用 250 µL 20% 甲醇以 25 µL/min 流速清洗该小柱。收集两份连续洗脱液（第 一份用 75 µL 甲醇以 7.5 µL/min 的流速洗脱，第二份用 75 µL 乙腈以 7.5 µL/min 的流速洗脱），并将其合并。

使用乙酸乙酯液液萃取法进行样品萃取

按照“水解”一节所述进行水解，但使用带螺口盖的单独玻璃管。将样品在碱性条件（pH 9.5）下用乙酸乙酯萃取 20 分钟，并收集有机层。将提取物在 40 °C 下氮吹至干，使用 50 µL MSTFA:NH4I:乙硫醇混合物在 80 °C 下衍生化 30 分钟。

数据采集和数据处理

采用两套系统进行 GC/MS 分析，即 Agilent 7250 GC/Q-TOF 和 Agilent 7000C GC/TQ。创建含有 320 种 WADA 禁止的外源性化合物及其代谢物的精确质量个人化合物数据库与谱库（PCDL），以便实施精确质量 GC/Q-TOF 筛查方法。使用 Agilent MassHunter 定性分析软件（10 版）将精确质量 EI 碎片转换为理论 m/z 值。然后使用 Agilent PCDL Manager 软件（8.0 版）将谱图导入精确质量 PCDL 中。采用 MassHunter 定量分析软件（10.2 版）进行进一步数据处理。

在兴奋剂检测领域使用 AssayMAP

Bravo 样品前处理平台的优势

与使用 AssayMAP Bravo 系统进行自动化样品前处理相比，使用乙酸乙酯进行手动样品萃取明显更耗时，且效率更低。蒸发 5 mL 乙酸乙酯需要大约 45 分钟，而对于 150 µL MeOH:ACN，则仅需要 10 分钟。此外，LLE 涉及额外的样品转移步骤，需要 30 分钟。自动化还可以显著缩短手动操作时间，因为在样品前处理过程中分析人员可以离开 AssayMAP Bravo，而采用手动方法时几乎需要持续关注。使用自动化样品前处理时，出错的风险也显著降低。另外，许多挥发性化合物（主要是兴奋剂）会随乙酸乙酯一起挥发，与自动化 SPE 相比，萃取回收率非常低。此外，加入衍生化试剂后的额外的样品转移步骤会导致回收率进一步降低。

使用 GC/Q-TOF 和 GC/TQ 仪器，对 LLE 程序（使用乙酸乙酯）与 AssayMAP Bravo 固相萃取方案的检出限进行了比较，如图 2 所示。对于非极性化合物（例如类固醇），使用 AssayMAP Bravo 样品前处理平台时 LOD 的改善并不十分明显，从仅降低百分之几到降至原来的 1/4 不等。LOD 降至原来的 1/4 是由于 AssayMAP 萃取具有明显更低的背景。对于极性较强的化合物（例如呋塞米，其最 新 LOD 低于 0.4 ng/mL），AssayMAP Bravo 萃取方法的灵敏度是先前LLE萃取方法的 200倍以上，并能在最 新 WADA MRPL 下实现检测（图 3）。

图 2. 使用乙酸乙酯 LLE（左）和 AssayMAP Bravo（右）萃取时的 LOD 比较：（A）3-0H- 普罗斯它诺唑，利用 GC/TQ 进行分析；和（B）异美汀，利用 GC/Q-TOF 进行分析。每种萃取技术所对应的 LOD 用红圈标记

图 3. 使用 AssayMAP Bravo 进行萃取时得到的呋塞米的 GC/Q-TOF LOD。LOD 用红圈标记

参考文献

1. Polet, M.; Van Gansbeke, W.; Van Eenoo, P. Development and Validation of an Open Screening Method for Doping Substances in Urine by Gas Chromatography Quadrupole Timeof-Flight Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta. 2018, 1042, 52–59. DOI: 10.1016/j.aca.2018.08.050

2. Balcells, G. et al. Detection and Characterization of Clostebol Sulfate Metabolites in Caucasian Population. J. Chromatogr. B. 2016, 1022, 54–63. DOI: 10.1016/j.jchromb.2016.03.028

3. Albertsdóttir, A. D. et al. Searching for New Long-Term Urinary Metabolites of Metenolone and Drostanolone Using Gas Chromatography–Mass Spectrometry with a Focus on NonHydrolysed Sulfates. Drug Test Anal. 2020, 12(8), 1041–1053. DOI: 10.1002/dta.2818

标签：GC/MS安捷伦