利用安捷伦 Cary3500 UV-Vis 实现小核酸药物开发中的关键热力学参数热解链温度（Tm）的高效分析

从 ASO 到 siRNA，

为何热解链温度测试关注度持续升级?

近年来，小核酸药物正逐渐成为继小分子药物和抗体药物之后的重要创新药物平台。在此影响下，反义寡核苷酸（ASO）、小干扰 RNA（siRNA）、核酸适配体（Aptamer）以及 CRISPR 相关核酸疗法不断取得突破，多款产品已经成功上市并应用于临床治疗。

而随着行业持续发展，小核酸研发的关注重点已不仅仅停留在“是否能够实现基因沉默”，而是进一步深入到更精细的问题之中：

如何提高靶标结合能力？

如何优化药效和安全性？

如何建立可靠的 CMC 表征体系？

如何评价核酸药物的稳定性和批次间一致性?

在这些问题背后，一个重要的热力学参数——热解链温度（Tm, Melting Temperature），正受到越来越广泛的关注。

Tm 是什么?

Tm 是指核酸双链结构中有 50% 发生解离时的温度。对于 DNA、RNA 以及各种化学修饰核酸而言，Tm 直观反映了核酸双链的热稳定性和杂交能力。简单来说：

Tm 越低，双链解离越容易。

Tm 越高，双链结合越稳定。

适宜的 Tm 通常意味着更理想的靶向结合能力。

在核酸药物研发中，Tm 测试结果已经成为评价序列设计质量的重要指标之一。

为什么 Tm 会影响药效？

以反义寡核苷酸（ASO）药物为例，药物依赖于其与靶 RNA 形成稳定的杂交结构。

如果 Tm 过低，ASO 与 RNA 结合不充分，会降低 RNase H 识别效率，并最终导致基因沉默效果减弱。

而如果 Tm 过高，往往意味着其具有更高的结合亲和力、更长的结合时间以及更强的 RNA 降解能力。

因此，Tm 常被用于 ASO 先导序列筛选和化学修饰优化的工作中。

核酸热解链分析的原理

核酸热解链实验基于经典的增色效应，可利用紫外-可见分光光度计实现分析测试。当温度升高时，双链结构之间的氢键逐渐断裂并开始解链，随着碱基暴露增加，样品在 260 nm 吸光度逐渐升高。通过连续监测样品在变温过程中 260 nm 吸光度的变化，可以获得熔解曲线、一阶导数曲线以及 Tm 值。通常情况下，典型的熔解曲线呈现 S 型变化，而熔解曲线处理后的一阶导数曲线峰值处的温度即为样品的 Tm。原理示意图如图 1 所示：

图 1. 核酸热解链分析原理示意图

利用安捷伦 Cary3500 UV-Vis

实现精准核酸 Tm 分析

当采用 UV-Vis 进行 Tm 测试时，该方法不仅操作简单，且具有样品消耗低、测试结果重复性好等优势，因此该方法已成为核酸热稳定性研究的经典手段。聚焦当下研发实际需求，安捷伦 Cary3500 UV-Vis 可见分光光度计配置多重能力，为核酸热解链研究提供了高效可靠的解决方案。

精准控温

核酸热解链实验对温度控制要求较高。Cary3500 UV-Vis 配备高性能的 Peltier 空冷控温系统，可实现 0-110℃ 区间的精准、稳定控温，且能保证良好的温度重复性，满足多种核酸样品的 Tm 测试需求。

多样品并行分析，提高研发效率

在小核酸研发过程中，科研人员经常需要进行不同序列设计方案、化学修饰、缓冲系统以及离子浓度的结果对比。传统单池仪器往往需要逐一进行样品测试，效率较低。而 Cary3500 UV-Vis 独特的 4 温区 8 池控温附件设计，支持同步独立测试 4 组样品，大幅度提升实验通量和数据获取效率。对于需要进行大量序列筛选的小核酸研发团队而言，这一优势尤为突出。

自动化数据处理

试验结束后，软件可自动生成吸光度-温度曲线、一阶导数曲线以及 Tm 测试结果。自动化数据处理帮助研究人员快速完成了样品比较、修饰评价以及稳定性研究，减少人工计算和数据处理工作量。

应用案例分享：核苷酸热稳定性评价

实验测试条件

150 uL 核苷酸溶液（4 umol/L）。

温度测试范围：20-90℃。

测试升温曲线后在 90℃ 停留 30min，然后自动采集降温曲线。

分别使用 0.5、1.0 和 2.0 ℃/min 温度速率进行测试。

要求升温及降温曲线的 Tm 差值不超过 1.0°C。

控温方式：将温度探头插入参比溶液，通过溶液温度进行实验温度控制。

参比光路放置常量比色皿并加转子进行搅拌；样品光路放置密封性好的微量比色皿盛装样品。

仪器测试示意图

测试结果

结果表明，利用比色皿内样品温度进行 Tm 实验温度控制可以更精准地实现样品表征，即使是测试微量样品也能获得准确的结果。Cary3500 UV-Vis 空冷控温模块具有更科学的设计，可以更好地满足科研人员对该项目测试温度精度的需求。

Tm 分析在小核酸研发中的价值

随着核酸药物产业的不断发展，Tm 分析正在从传统研究工具逐渐成为核心表征手段之一。其应用贯穿药物研发的每个阶段：

序列设计与筛选

化学修饰优化

药效研究

制剂开发

稳定性评价

CMC 表征

批次间一致性研究

结语

在小核酸药物研发过程中，Tm 不仅是衡量核酸热稳定性的关键参数，更是连接序列设计、药效优化与 CMC 表征的重要指标。安捷伦 Cary 3500 UV-Vis 凭借精准温控、多样品并行检测以及自动化数据分析能力，为 ASO、siRNA 及其他核酸药物研究提供了高效可靠的热解链分析解决方案，助力研发人员更快获得高质量热力学数据，加速了创新药物开发的进程。

您是否已经在小核酸研发项目中开展了 Tm 分析？欢迎留言分享您的应用经验。若想要获取更多信息，您也可以通过点击下方链接，查看我们专为 Tm 测试用户编制准备的白皮书，文章系统介绍了 Tm 分析测试中的注意事项以及相关问题解决方法。如需进一步了解安捷伦 Cary3500 UV-Vis 在 Tm 分析中的应用方案，也欢迎随时与我们联系。

https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-tips-tm-measurements-5994-4028zh-cn-agilent.pdf

标签：安捷伦