色谱课堂|反相高比例水相分析时的难点剖析

当分析强极性化合物（如Vitamin C）时，可能需要使用高水相流动相。这是由于反相柱固定相为非极性，对极性化合物保留能力较弱。需要增加流动相中的水含量来提高保留，但实际操作中会遇到一些问题。我们将一同探讨这些问题并提供解决方案。

C8和C18固定相是非极性的油状物质，与水的相互作用有限。当流动相水含量过高时，会导致固定相润湿失败，引发"疏水塌陷"现象，使固定相失去保留能力。例如，含甲醇/水混合流动相时，C8/C18固定相可正常润湿；当出现纯水流动相时，固定相发生"去湿"现象。

 常见问题 

高水相（强极性）流动相与非极性固定相相溶性差。水的强极性使其无法有效润湿C8/C18固定相表面，导致固定相与分析物相互作用不足，影响分离效率。

持续使用高水相流动相会造成固定相孔隙闭合。由于水的高表面张力无法充分渗透孔道，分析物失去相互作用位点，导致保留能力下降和分离失败。

固定相去湿后，需用非极性溶剂冲洗色谱柱进行再生。此过程耗时且可能无法完全恢复柱效。

水相过高会导致保留时间不稳定和峰拖尾现象，源于固定相-分析物相互作用的不稳定导致。

使用高水相流动相时可采取以下措施：

策略1：
采用可耐受纯水的反相柱，例如Kromasil Classic C18(w)，或其他品牌的AQ柱等。

策略2：
采用短链烷基固定相（如C4），其更大自由体积和更少屏蔽效应可改善固定相润湿性。

策略3：
选用大孔径固定相（如300?），更宽孔径有利于水分子渗透。

结论

在HPLC分析中，C8/C18色谱柱使用高水相流动相时，可能发生疏水塌陷、保留时间不稳定性、峰形畸变，以及色谱柱再生困难等问题。通过选择可耐受纯水的Kromasil Classic C18(w)或适宜的固定相类型（亲水修饰/短链烷基/大孔径）和未封端色谱柱，可有效改善高水相条件下的分离性能及稳定性。

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