用户文章丨《The ISME Journal》中国科学院广州地球化学研究所李继兵、罗春玲老师团队发表了原位菲降解菌分选培养新思路

2024年6月24日，中国科学院广州地球化学研究所罗春玲、李继兵老师团队在《The ISME Journal》期刊发表了题为“Microbial consortium assembly and functional analysis via isotope labelling and single-cell manipulation of polycyclic aromatic hydrocarbon degraders”的论文。文章采用¹³C同位素标记结合拉曼活细胞分选，分离培养了土壤中原位降解菲的功能菌并成功构建了原位高效菲降解的合成微生物菌群；并通过基因组分析阐明了功能微生物菌群原位作用机制。其中，核心产品——PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪为文中原位构建功能微生物群落过程中的功能菌鉴定分选提供了便捷高效的工具。

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微生物在地球生物化学循环中发挥着关键作用，对污染物的降解和转化至关重要，而在环境污染物降解过程中，功能微生物往往以群落的形式运作，而非单个微生物。土壤微生物群落构成了地球上高度多样化和复杂的微生物群，然而，其原位代谢有机污染物的机制尚不清楚。传统的土壤微生物研究多依赖培养技术进行分离和研究，但通过常规方法获得的降解污染物的高效微生物在实际环境中的降解效果往往不理想。因此，构建原位功能微生物群落（Functional Microbial Consortia, FMCs）成为揭示复杂环境中微生物群落中功能代谢菌统一功能表型和内在机制的最优策略。通过FMCs的构建，能够有效整合微生物群落中不同物种在污染物降解过程中的协同作用，提升微生物的功能稳定性和降解效率，克服传统依赖单菌株或常规方法的局限。

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本文选取了石油污染区域的土壤为研究对象，以典型有机污染物多环芳烃中的菲（Phenanthrene, PHE）作为模型化合物，探究土壤微生物群落如何协同降解污染物。研究通过使用¹³C同位素标记的PHE对污染土壤进行孵育，随后利用拉曼活细胞分选（Raman-Activated Cell Sorting, RACS）技术筛选出高代谢活性的PHE降解菌群。对筛选出的高代谢活性PHE降解菌群进行单细胞测序与培养，确定其降解PHE的作用机制。最后，将通过RACS技术筛选出的PHE降解菌群与传统培养方法获取的PHE降解菌群进行对比，评估其对污染土壤修复的潜力。同时，采用DNA稳定同位素探针（DNA-SIP）技术验证RACS识别与分选出的功能微生物组成。

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1. 微生物群落中活性PHE降解菌的SIP鉴定

在分别加入¹²C和¹³C标记的PHE后，两组内的微生物群落结构没有发生显著变化，但与未添加PHE的原始土壤孵育组相比，部分菌属的丰度较原始土壤升高(图1A)。经过超速离心后确定不同处理的“轻”(¹²C标记)和“重”层(¹³C标记)DNA (图1B)。对不同浮力密度DNA带进行16S rRNA扩增子测序，得到对应于¹²C-PHE及¹³C-PHE处理中的微生物物种丰度。对测序结果进行REF(相对富集因子)参数统计，结果发现ASV_29和ASV_37所代表的微生物分别具有3.09和3.34的高REF值，这两个ASV分别属于Pseudomonas和Achromobacter属，分别与Pseudomonas sp. A131 (MT437044.1)和Achromobacter sp. DN1727 (OL614679.1)具有最高的一致性。

图1 ¹²C-PHE、¹³C-PHE与未处理组的16S rRNA扩增子测序的差异与相关性

图1. A为¹²C-PHE、¹³C-PHE与未处理组的16S rRNA扩增子测序后的物种差异；B为DNA分数与其片段所在位置的浮力密度(BD, g/mL)之间的相关性；C为16S rRNA丰度与DNA浮力密度(BD, g/mL)之间的相关性

¹²C-PHE代谢菌在拉曼光谱1001 cm^-1位置处(苯丙氨酸峰位)表现出明显的拉曼峰，¹³C-PHE标记的高活性PHE代谢菌在拉曼光谱中呈现苯丙氨酸峰的红移，特征峰从1001 cm^-1红移至968 cm^-1。

图2 土壤中活性PHE降解物的RACS

图2. A为¹²C-PHE和¹³C-PHE原位孵育后细胞的单细胞拉曼光谱；B为968和1001 cm^?1的拉曼波段强度统计；C为活性PHE降解菌分选前后镜下视野比较；D为基于Illumina 测序的两种RACS分类微生物的相对丰度

采用PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪对上述¹³C标记的活性PHE降解菌进行单细胞分选，共分选出60个单细胞进行后续的基因组测序(图2C)。测序结果得到两个完整度分别为70.6% (bin1)和76.1% (bin2)的组装基因组(图3AB)，这两个基因组分别属于Achromobacter属和Pseudomonas属，与16S rRNA扩增子测序结果中的ASV_37和ASV_29相对应。

图3 组装基因组bin1和bin2的单细胞测序结果

图3. A为bin1的单细胞测序组装结果圈图；B为bin2的单细胞测序组装结果圈图；C为bin1和bin2的辅助因子和维生素代谢的基因统计；D为二者氧化酶、耐药性等相关的基因统计

图4 不同分离方法得到的高效PHE降解菌在MM培养基或原位条件下的PHE代谢活性

最后，为了探究两种菌构建的菌群的作用机制，对前述bin1、bin2的组装基因组进行深入探究，明确了参与PHE代谢的主要基因类别，确定了原位分离的JB-1、JB-2对PHE的代谢途径 (图5)。

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本研究通过SIP-RACS技术分离培养了一株Pseudomonas属(JB-1)和一株Achromobacter属(JB-2) PHE降解菌，并实现了原位功能菌群的构建，证实了原位功能菌群在实际土壤中对PHE的降解能力优于传统方法构建的PHE降解菌群。结合16S rRNA扩增子测序与单细胞测序结果将PHE降解菌的表型与基因联系起来，揭示了石油污染土壤环境中的PHE的降解机制，为环境功能菌群原位机制探究提供了新的思路。

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