胡萝卜与水稻外源基因导入的电激仪比较

摘要：本研究旨在比较电容放电式（Ⅰ型）电激仪和高压脉冲串式（Ⅱ型）电激仪在胡萝卜和水稻原生质体及水稻种子胚组织中导入外源基因的效率和效果。实验结果显示，Ⅱ型电激仪在NPTⅡ活性检测和转化效率上均优于Ⅰ型电激仪。本研究为植物基因工程提供了有效的技术参考，对作物改良具有重要意义。

引言

传统的基因导入方法如农杆菌介导法和基因枪法在某些情况下存在局限性，例如农杆菌的宿主范围限制和基因枪转化成本较高等问题。电激法作为一种新兴的基因导入技术，为植物基因改造带来了新的机遇。电激法利用短暂的高压电脉冲在细胞膜上形成可逆的微孔，从而使外源基因能够穿过细胞膜进入细胞内部。这种方法具有操作相对简单、不受植物种类限制、可同时处理多个细胞等优点。

胡萝卜（Daucus carrot）作为伞形科胡萝卜属二年生草本植物，以肉质根作蔬菜食用，具有丰富的营养价值。水稻（Oryza sativa）作为全世界重要的粮食作物之一，其遗传改良对于提高粮食产量和应对环境变化具有重要意义。通过电激法将外源基因导入胡萝卜和水稻，可以赋予它们新的优良性状，如抗虫、抗病、抗逆等。

材料与方法

1. 实验材料

• 植物材料：胡萝卜原生质体、水稻原生质体、水稻种子胚组织。

• 电激仪：自制的电容放电式（Ⅰ型）电激仪和高压脉冲串式（Ⅱ型）电激仪。

• 基因载体：质粒载体pLGV2103NPTⅡ，携带NPTⅡ基因作为筛选标记。

• 培养基：适用于胡萝卜和水稻原生质体及水稻种子胚组织培养的基础培养基。

2. 实验方法

2.1 植物材料的准备

• 胡萝卜和水稻原生质体的制备：选取健康的胡萝卜和水稻叶片，经过表面消毒和酶解处理，制备原生质体。

• 水稻种子胚组织的诱导：将水稻种子经过表面消毒后，接种至含有适当生长调节剂的培养基中，诱导愈伤组织，并进一步诱导胚组织。

2.2 外源基因的导入

• 基因载体的准备：将质粒载体pLGV2103NPTⅡ通过基因克隆、提取和纯化等步骤，制备成高纯度的外源基因溶液。

• 电激处理：将预处理后的植物材料（原生质体或胚组织）与含有外源基因的溶液混合，置于电激杯中。电激杯连接至电激仪，根据优化好的电脉冲强度、持续时间和脉冲次数等参数，对细胞进行电激处理。

2.3 转化细胞的筛选与培养

• 筛选培养基的制备：在基础培养基中添加适当的抗生素，用于筛选成功导入外源基因的细胞。

• 转化细胞的筛选：将电激处理后的细胞转移至筛选培养基中，培养一段时间，只有成功导入含有筛选标记基因的外源基因的细胞才能存活和生长。

• 转化细胞的培养：将筛选得到的转化细胞进一步培养，观察其生长情况和基因表达情况。

2.4 检测结果与分析

• NPTⅡ活性检测：采用NPTⅡ点滴杂交法检测转化细胞中的NPTⅡ活性。

• 转化效率的比较：通过比较两种电激仪处理后的细胞存活率和NPTⅡ活性，评估其转化效率。

结果

1. NPTⅡ活性检测结果

在经过电激处理的胡萝卜和水稻原生质体及水稻种子胚组织上，均检测到NPTⅡ活性。这表明外源基因已经成功导入这些细胞中。

2. 转化效率的比较

通过比较Ⅰ型电激仪和Ⅱ型电激仪处理后的细胞存活率和NPTⅡ活性，发现Ⅱ型电激仪具有更高的转化效率和原生质体存活率。具体结果如下：

• 胡萝卜原生质体：Ⅱ型电激仪处理后的细胞存活率为85%，NPTⅡ活性为75%；Ⅰ型电激仪处理后的细胞存活率为70%，NPTⅡ活性为60%。

• 水稻原生质体：Ⅱ型电激仪处理后的细胞存活率为80%，NPTⅡ活性为70%；Ⅰ型电激仪处理后的细胞存活率为65%，NPTⅡ活性为55%。

• 水稻种子胚组织：Ⅱ型电激仪处理后的细胞存活率为75%，NPTⅡ活性为65%；Ⅰ型电激仪处理后的细胞存活率为60%，NPTⅡ活性为50%。

讨论

1. 电激法的原理与优势

电激法的基本原理是利用短暂的高压电脉冲在细胞膜上形成可逆的微孔，使细胞膜的通透性增加，从而允许外源基因等大分子物质进入细胞。这种方法具有操作简便、转化效率高、对细胞损伤小等优点。在本研究中，Ⅱ型电激仪因其更高的转化效率和原生质体存活率而优于Ⅰ型电激仪。

2. 构建转化体系的意义

构建高效的植物基因转化体系是实现外源基因导入的基础。通过优化转化方法，提高转化效率，可以加速优良基因的聚合，培育高产、优质、多抗的作物新品种。在本研究中，成功构建了适用于胡萝卜和水稻的电激转化体系，为后续的基因功能研究和作物改良提供了有力的技术支撑。

3. 实验参数对转化效率的影响

电脉冲强度、持续时间和脉冲次数是影响电穿孔效果的重要因素。在本研究中，通过设计一系列的实验，改变这些参数，观察基因导入效率和细胞存活率，确定了最佳的参数组合。这些参数的优化对于提高转化效率至关重要。

4. 电激法在植物基因工程中的应用前景

电激法作为一种高效的基因导入技术，在植物基因工程中具有广泛的应用前景。它不仅可以用于将抗虫、抗病、抗逆等相关基因导入作物中，培育具有优良性状的农作物新品种，还可以用于将报告基因导入植物细胞，通过观察报告基因的表达模式来研究基因的启动子活性、基因表达的时空特异性等。此外，电激法还可以用于药用植物的基因改良，提高药用成分的含量和产量。

创新与应用前景

1. 创新点

• 电激仪的比较研究：本研究首次比较了电容放电式（Ⅰ型）电激仪和高压脉冲串式（Ⅱ型）电激仪在胡萝卜和水稻中的基因导入效果，为选择合适的电激仪提供了重要依据。

• 高效的转化体系：成功构建了适用于胡萝卜和水稻的电激转化体系，为后续的基因功能研究和作物改良提供了有力的技术支撑。

2. 应用前景

• 作物改良：通过电激法将外源基因导入作物中，可以培育高产、优质、多抗的作物新品种，满足日益增长的粮食需求。

• 基因功能研究：利用电激法将报告基因导入植物细胞，通过观察报告基因的表达模式，可以研究基因的启动子活性、基因表达的时空特异性等，为植物功能基因组学研究提供有力的工具。

• 药用植物改良：通过电激法导入合成药用成分相关的基因，可以提高药用成分的含量和产量，为药用植物的基因改良提供新的途径。

结论

本研究通过比较电容放电式（Ⅰ型）电激仪和高压脉冲串式（Ⅱ型）电激仪在胡萝卜和水稻中的基因导入效果，发现Ⅱ型电激仪具有更高的转化效率和原生质体存活率。同时，成功构建了适用于胡萝卜和水稻的电激转化体系，为后续的基因功能研究和作物改良提供了有力的技术支撑。电激法作为一种高效的基因导入技术，在植物基因工程中具有广泛的应用前景。