Biochrom Bio 30+ 在细胞培养基中研究氨基酸降解过程的应用 | 干货速递

试验方法

实验使用英国品牌Biochrom 的Bio 30+氨基酸分析仪分析各种细胞培养基的氨基酸浓度。简单来说，培养基样品使用离子交换液相色谱法（IEX）进行检测，并用柠檬酸锂缓冲液按照1:1稀释。HP高效锂系统程序分别取0,14,33,68和96天的细胞培养基样品进行检测，注射体积为20μL（样品和标准品均为20μL），并通过使用添加了色氨酸（Trp）和谷氨酰胺的钠水解缓冲液校准数据。进行实验的细胞培养基分别是：DMEM (D6046, Sigma-Aldrich; SA) ，DMEM (11885084, ThermoFisher; TF), DMEM high-glucose (D6429, Sigma-Aldrich; HG), DMEM F-12 Ham (D8437, Sigma-Aldrich; HAM), 以及 DMEM GlutaMAX (10567014, ThermoFisher; GM)。所有的培养基均以4摄氏度保存。数据通过Biochrom自制的Pheonix软件获取，随后使用OpenLab软件进行数据分析。

Phoenix Software

Biochrom Bio 30+氨基酸分析仪实验流程示意图；系统包括控制单元（仪器左侧）、自动取样器（仪器右侧）和Phoenix软件。每个样品的制备时间约为1分钟。系统自动运行每个样品的时间约为130分钟（且系统可过夜运行），样品之间有43分钟的自动pH重置步骤。此离子交换色谱法（IEX）可在检测时不受样品介质中无机盐、糖、维生素或其他添加剂的干扰

试验结果

下图为每种试验培养基样品中的氨基酸浓度（mg/L）。数据以第0天和第14天相应培养基中每种氨基酸检测浓度的平均值±标准差（SD）表示。谷氨酰胺检测中显示的高值标准差SD表明样品降解。#是指DMEM-GM培养基中存在的丙氨酸Ala-谷氨酰胺Gln的校准浓度值。

下图为谷氨酰胺在时间流逝下的降解情况。图为DMEM-SA培养基在第0天和第96天的锂色谱图。下方的标准色谱图显示出了各类氨基酸峰的标记。牛磺酸（Tau）和缬氨酸（Val）用作内部对照，氨（Amm）用作证实氨基酸分解的标志物。在实验期间，谷氨酰胺的检测浓度显著降低，谷氨酰胺峰的曲线下面积（AUC）降低了20%。同时，氨的浓度增加，氨峰的曲线下面积上升了35%，表明谷氨酰胺正在降解。

下图为谷氨酰胺降解的表征。图A：第0天（细胞培养基到达后一天）检测的氨基酸浓度与制造商数据表的偏差。这些点代表氨基酸的各个数据点（谷氨酰胺代表橙色，其他氨基酸代表蓝色）。水平线表示平均值，虚线表示标准偏差SD。*代表与制造商数据表相比，p < 0.05，统计方式是Tukey事后检验的单因素方差分析。图B：在实验期间，谷氨酰胺的检测浓度显著降低（降低了26%）。数据符合指数衰减函数，并估算出了谷氨酰胺在DMEM-SA培养基中的半衰期（53.37±16.73天）。右上角的图表显示了第14天时对比DMEM-GM培养基中存在的丙氨酸Ala-谷氨酰胺Gln，所有细胞培养基中谷氨酰胺相对降解的情况。

自动化的离子交换色谱法（IEX）免受检测样品介质产生的数据干扰。下图为第0天（蓝色）和第14天（橙色）测试介质（不包含DMEM-GM培养基）的平均锂色谱图。彩色线表示所有色谱图的平均值，阴影表示相关的标准差。色谱图的高相关性（第0天r=0.94±0.05，第14天r=0.98±0.01）表明Biochome Bio30+的离子交换色谱法技术不受检测介质中无机盐、糖、维生素或其他添加剂的干扰。右上角的四个图表明了从第0天到第14天检测介质中谷氨酰胺的降解。下方的标准色谱图显示出了各类氨基酸峰的标记。牛磺酸（Tau）和缬氨酸（Val）用作内部对照，氨（Amm）用作证实氨基酸分解的标志物。

结论