周期型马来丝虫多基因克隆构建载体转染细胞

摘要：本文详细阐述了周期型马来丝虫多基因克隆构建载体及转染细胞的研究，通过RT-PCR技术扩增目标基因，构建原核及真核表达载体，并转染HeLa细胞进行表达分析。研究成功构建了多基因转化体系，为丝虫病疫苗及抗虫药物的研发提供了基础。

引言

马来丝虫（Brugia malayi）是一种寄生在人体淋巴系统中的丝虫，可引起马来丝虫病。根据其微丝蚴出现于外周血液的时间，马来丝虫可分为夜现周期型和亚周期型。周期型马来丝虫成虫寄生于人体四肢浅部淋巴系统，特别是下肢，导致急性淋巴结炎、淋巴管炎及象皮肿等症状。马来丝虫病的防治主要依赖于药物治疗，然而，药物的副作用及抗药性的出现使得疫苗研发变得尤为重要。

热休克蛋白70（HSP70）作为一种重要的免疫原，在多种寄生虫中均有表达，并显示出良好的免疫保护效果。此外，马来丝虫M29编码基因也被认为是一种潜在的疫苗候选分子。因此，克隆和表达这些基因，构建其转化体系，对于开发抗丝虫感染疫苗及药物具有重要意义。

本研究旨在克隆周期型马来丝虫HSP70基因及M29编码基因，构建原核及真核表达载体，并转染HeLa细胞进行表达分析，从而为丝虫病疫苗及抗虫药物的研发提供基础。通过多基因克隆及载体构建，我们期望能够筛选出高效表达的基因，进一步推进丝虫病防治策略的发展。

材料与方法

1. 实验材料

• 虫体材料：周期型马来丝虫成虫，由南通大学医学院寄生虫学教研室提供。

• 细胞系：HeLa细胞，购自ATCC细胞库。

• 载体：原核表达载体pGEX-4T-3，真核表达载体pcDNA3.1（+），由实验室保存。

• 试剂：某试剂RNA提取试剂盒、某试剂反转录试剂盒、某试剂PCR扩增试剂盒、某试剂DNA凝胶回收试剂盒、某试剂T4 DNA连接酶、某试剂质粒提取试剂盒、某试剂限制性内切酶、某试剂IPTG诱导剂、某试剂细胞培养基、某试剂转染试剂。

• 仪器：某品牌台式高速离心机、某品牌紫外可见分光光度计、某品牌高压灭菌器、某品牌凝胶成像系统、某品牌PCR仪、某品牌水平电泳槽、某品牌电泳仪、某品牌恒温培养箱、某品牌电热恒温鼓风干燥箱、某品牌恒温水浴箱、某品牌旋涡振荡器、某品牌超净工作台、威尼德电穿孔仪。

2. 实验方法

2.1 总RNA提取及反转录

• 从周期型马来丝虫成虫中提取总RNA，使用某试剂RNA提取试剂盒按照说明书操作。

• 将提取的总RNA反转录为cDNA，使用某试剂反转录试剂盒，按照说明书操作。

2.2 基因克隆及载体构建

• 根据GenBank上公布的周期型马来丝虫HSP70基因（登录号：M68933）及M29编码基因的序列，设计引物。

• 使用某试剂PCR扩增试剂盒，以cDNA为模板扩增目的基因。

• PCR产物经某品牌凝胶成像系统检测后，使用某试剂DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。

• 将目的片段与原核表达载体pGEX-4T-3及真核表达载体pcDNA3.1（+）分别进行双酶切，使用某试剂限制性内切酶，按照说明书操作。

• 使用某试剂T4 DNA连接酶将目的片段与载体连接，构建重组质粒。

• 将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α中，涂布于含抗生素的LB平板上，37℃恒温培养箱培养过夜。

• 挑取单克隆菌落，使用某试剂质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切鉴定及测序验证。

2.3 重组蛋白表达及鉴定

• 将构建成功的重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布于含抗生素的LB平板上，37℃恒温培养箱培养过夜。

• 挑取单克隆菌落，接种于含抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养至OD600达到0.6-0.8。

• 加入IPTG诱导剂，37℃恒温摇床继续培养4小时。

• 收集菌体，使用SDS-PAGE进行蛋白表达分析，使用某品牌凝胶成像系统检测目的蛋白的表达情况。

2.4 细胞转染及表达分析

• 将HeLa细胞接种于6孔板中，培养至细胞密度达到70%-80%。

• 使用某试剂转染试剂，按照说明书操作，将构建成功的真核表达载体转染至HeLa细胞中。

• 转染后48小时，收集细胞，使用SDS-PAGE进行蛋白表达分析，使用某品牌凝胶成像系统检测目的蛋白的表达情况。

实验结果

1. 基因克隆及载体构建

成功克隆了周期型马来丝虫HSP70基因及M29编码基因，并构建了原核表达载体pGEX-4T-3-HSP70、pGEX-4T-3-M29及真核表达载体pcDNA3.1（+）-HSP70、pcDNA3.1（+）-M29。双酶切鉴定及测序验证结果表明，构建的重组质粒符合预期大小，且序列正确。

2. 重组蛋白表达及鉴定

在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达了重组蛋白GST-HSP70及GST-M29，SDS-PAGE分析结果显示，诱导组出现特异性蛋白表达条带，与预计大小相符。目的蛋白占菌体总蛋白的10%-15%。

3. 细胞转染及表达分析

成功将真核表达载体pcDNA3.1（+）-HSP70及pcDNA3.1（+）-M29转染至HeLa细胞中，SDS-PAGE分析结果显示，转染组出现特异性蛋白表达条带，与预计大小相符。目的蛋白在HeLa细胞中成功表达。

讨论

本研究成功构建了周期型马来丝虫HSP70基因及M29编码基因的原核及真核表达载体，并实现了在大肠杆菌及HeLa细胞中的高效表达。这一研究为丝虫病疫苗及抗虫药物的研发提供了基础。

1. 基因克隆及载体构建策略

在基因克隆及载体构建过程中，我们选择了常用的EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶进行双酶切，以确保目的片段与载体的正确连接。同时，通过测序验证确保了构建的重组质粒序列正确，为后续实验提供了可靠的基础。

2. 重组蛋白表达及鉴定

在大肠杆菌中表达重组蛋白时，我们选择了IPTG诱导剂进行诱导表达，并通过SDS-PAGE分析鉴定了目的蛋白的表达情况。结果表明，构建的重组质粒能够在大肠杆菌中稳定表达目的蛋白，且表达量较高。这一结果为后续纯化及功能研究提供了基础。

3. 细胞转染及表达分析

在细胞转染实验中，我们选择了常用的某试剂转染试剂进行转染，并通过SDS-PAGE分析鉴定了目的蛋白在HeLa细胞中的表达情况。结果表明，构建的真核表达载体能够成功转染至HeLa细胞中，并表达目的蛋白。这一结果为后续免疫学研究及疫苗研发提供了基础。

4. 研究的创新与应用前景

本研究的创新之处在于成功构建了周期型马来丝虫多基因克隆转化体系，并实现了在大肠杆菌及HeLa细胞中的高效表达。这一研究为丝虫病疫苗及抗虫药物的研发提供了新的思路和方法。未来，我们将进一步开展免疫学研究，评估目的蛋白的免疫保护效果，为丝虫病防治策略的发展提供科学依据。