植物外源 DNA 导入方法研究成果与走向

构建重组载体：将目的外源基因克隆到含有 T - DNA 区域的 Ti 质粒载体上，构建重组 Ti 质粒。

农杆菌转化：将重组 Ti 质粒导入农杆菌感受态细胞中，通过筛选获得含有重组 Ti 质粒的农杆菌菌株。

植物材料准备：选择合适的植物外植体，如叶片、茎段、胚等，进行表面消毒处理。

共培养：将经过活化培养的农杆菌与植物外植体在含有乙酰丁香酮等诱导物质的培养基上共培养，促进农杆菌对植物细胞的侵染。

筛选与分化：共培养结束后，将外植体转移到含有抗生素的筛选培养基上，筛选出被农杆菌转化且含有外源基因的细胞。这些细胞经过诱导分化，形成再生植株。

制备微弹：将外源 DNA 与金属微粒（如金粉）混合，通过化学处理使 DNA 吸附在金属微粒表面，制备成微弹。

植物材料准备：选取合适的植物材料，如愈伤组织、胚性细胞团等，将其放置在基因枪轰击的合适位置。

参数设置与轰击：将制备好的微弹装入基因枪的发射装置中，调整好参数，如气压、轰击距离、轰击次数等，对植物材料进行轰击。

培养与筛选：轰击后的植物材料在合适的培养基上进行恢复培养，然后转移到含有筛选剂的培养基上，筛选出含有外源基因的细胞或组织，进一步培养分化成再生植株。

外源 DNA 制备：提取和纯化目的外源 DNA，确保其纯度和完整性。

授粉与处理：在植物开花授粉后，根据不同植物的特性，选择合适的时间，用微量注射器或其他工具将外源 DNA 溶液注入到花柱或子房内，使外源 DNA 沿着花粉管通道进入胚囊。

收获与筛选：正常培养处理后的植株，收获种子。将收获的种子播种，在后代植株中通过分子生物学检测方法，如 PCR、Southern blot 等，筛选出含有外源基因的转基因植株。

原理：电击法是利用高压电脉冲在植物细胞膜上形成瞬时的微孔，使外源 DNA 能够通过这些微孔进入细胞。当细胞膜恢复正常状态后，外源 DNA 被包裹在细胞内，从而实现基因转导。

实验步骤：将植物细胞或原生质体制备成悬浮液，与外源 DNA 充分混合。将细胞 - DNA 混合液转移到电击杯中，设置合适的电击参数，如电压、脉冲宽度、脉冲次数等。然后进行电击操作，完成后将细胞迅速转移到含有培养基的培养器皿中，进行培养和筛选。

研究成果与特点：电击法在植物基因转化中也有应用，尤其在原生质体转化方面具有一定优势。该方法的优点是操作相对简单，转染效率较高，可适用于多种植物细胞类型。但电击法对细胞的损伤较大，原生质体的制备和培养过程较为复杂，限制了其在实际应用中的推广。

原理：PEG（聚乙二醇）是一种高分子聚合物，它可以改变细胞膜的通透性，促使外源 DNA 进入植物原生质体。当 PEG 与植物原生质体和外源 DNA 混合时，能够诱导原生质体摄取外源 DNA，实现基因转化。

实验步骤：制备植物原生质体，将其与外源 DNA 和 PEG 溶液混合，在适当条件下孵育一段时间，使 PEG 发挥作用促进外源 DNA 进入原生质体。孵育结束后，通过离心等方法去除 PEG，将原生质体培养在合适的培养基上，诱导其再生细胞壁并分裂分化，筛选出含有外源基因的细胞和再生植株。

研究成果与优势：PEG 介导法在一些植物的遗传转化中取得了一定成果，如在一些蔬菜和花卉植物的基因转化中有所应用。该方法的优点是操作相对简便，对细胞的损伤较小，且成本较低。然而，PEG 介导法的转化效率相对较低，且原生质体的培养和再生技术要求较高，限制了其广泛应用。