免疫酶组织化学技术的常用酶及其底物

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免疫酶组织化学技术的常用酶及其底物（一）辣根过氧化物酶在免疫酶技术中，辣根过氧化物酶（HRP）是Z理想、应用Z多的标记酶，是从一种称为辣根的植物根部分离、纯化获得。HRP分子中含有含铁血红素基团（高铁血红素），是HRP的活性基团，在溶液中呈棕黄色，HRP中的高铁血红素与H202形成一种复合物，然后脱水，氧原子形成。几种底物可使HRP氧化，Z常用的有二种，即多酚和硝基盐。HRP的优点有以下几个方面。（1）体积小（分子质量40kDa），不会遮盖抗原的结合部位，且穿透力强，易与细胞内抗原结合。（2）稳定且易获得高纯度酶制品。（3）具有较高活性及特异性。（4）不溶性好，终产物不向周边扩散。（5）组织中内源性酶较少，YZ方法较多。（6）价格相对较便宜。（7）特异性底物是过氧化氢（H202），可选用不同电子供体（发色基团），使终产物呈不同颜色。例如3，3’二氨基联苯胺（DAB）为棕褐色，3氨基9乙基卡巴唑（AEC）为红色，4氯1苯酚（CN）为蓝色。AEC室温下较稳定，产物不溶于水，但溶于有机溶剂，所以不能进行脱水等处理；又因其需用水溶性封固剂，时间长易褪色，限制了其应用。DAB是广泛应用的电子供体，产物既不溶于水，又不溶于有机溶液，可长期保存。其终产物具有嗜锇性，经锇酸处理后电子密度增加，适用于电镜下观察。但DAB的缺点是具有潜在的致癌性，所以应尽量减少吸人和接触次数，并严格管理废液。尽管有人反对应用DAB，但目前还未找到一种比它更好的替代品，所以应用依然Z为广泛。HRP与底物H202呈色反应原理见图4l。HRP的特异底物为H202，在分解Hz02过程中，与H202形成初级复合物，无电子供体时，反应不再继续进行，当电子供体存在时，反应以一定的速度形成第二种复合物。HRP催化H202已形成的中间型产物，迅速生成水，酶被还原，电子供体被氧化、聚合，再经氧化环化?Z后形成吲哚胺多聚体，此多聚体进一步氧化、环化，形成苯乙肼聚合体，如供氢体是DAB，产物为棕褐色；如是AEC，产物为红色。（二）碱性磷酸酶目前商品化的AKP均来源于牛小肠，称为牛肠碱性磷酸酶（calfintestinalkalinephosphatase），其分子质量为100kDa，故而穿透细胞组织的能力较弱。某些组织细胞内含有较高的内源性碱性和酸性磷酸酶，例如人体和鼠类、狗等动物组织的肝、肾、肠，对IHC染色会产生一定的干扰，因此限制了它的应用。AKP主要用于血涂片或涂片的白细胞抗原检测。但是由于AKP的呈色反应的敏感性要比HRP高23倍，显色时间可从30min到48h，可与HRP组合进行IHC的双重或多重标记。另外，内源性碱性磷酸酶可以在底物缓冲液中加入左旋咪唑（1evamisole）和镁离子（氯化镁），或提高底物缓冲液的pH值，可以有效地消除内源性碱性磷酸酶，使该酶应用比例日趋增多。目前该酶已广泛应用于原位杂交检测的显色和双重酶标染色。（三）葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase，GOD）以葡萄糖为底物，生成蓝色不溶性沉淀。该终产物较稳定，不溶于有机溶剂，故易保存，但因其分子质量为150kDa，不能穿人细胞，影响了其应用。另外，该酶的敏感性较低，主要是酶与底物反应敏感性低。目前主要用于IHC的多重标记。免疫酶组织化学技术的常用酶及其底物
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