线粒体呼吸链复合物II活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

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线粒体呼吸链复合物II活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途线粒体呼吸链复合物II（琥珀酸－辅酶Q还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q同功类似物二氯酚靛酚，通过反应系统测定样品中二氯酚靛酚还原后吸光峰值的变化，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的琥珀酸－辅酶Q还原酶的特异性活性检测。可用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。技术背景线粒体呼吸链复合物II，通常称为琥珀酸－辅酶Q还原酶或琥珀酸脱氢酶（Succinate-CoenzymeQReductase；SuccinateDehydrogenase），是线粒体电子传递链与三羧酸循环链接的载体：含有四个亚单位，包括共价结合的辅基黄素腺嘌呤二核苷酸（flavinadeninedinucleotide；FAD）和三个铁硫ZX（Fe-Sclusters），以及细胞色素b亚单位，其Z特征性的酶活性是丙二酸钠敏感的琥珀酸－辅酶Q还原酶。复合物II催化琥珀酸（succinate）被氧化为富马酸（fumarate），线粒体内电子由供体FAD传递到内膜上辅酶Q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，进行呼吸链传递。该酶异常会导致嗜铬细胞瘤（paraganglioma）、肾上腺嗜铬细胞瘤（pheochromocytoma）和Leigh综合征。基于琥珀酸底物，通过琥珀酸－辅酶Q还原酶的催化，氧化为富马酸，同时氧化型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIP）转化为还原型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIPH2），在分光光度仪下产生吸光峰值的变化（600nm波长），由此定量测定琥珀酸－辅酶Q还原酶的特异活性。其反应系统是：ComplexIISUCCINATE+DCPIP+CoQ→FUMARATE+DCPIPH2+CoQH2蓝色无色↑Abs600nm↓Abs600nm产品内容缓冲液（ReagentA）20毫升反应液（ReagentB）2.5毫升阴性液（ReagentC）2毫升底物液（ReagentD）500微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；反应液（ReagentB）和底物液（ReagentD），避免光照，有效保证6月用户自备比色皿：用于比色的容器分光光度仪：用于比色分析培养箱：用于孵育反应物实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；缓冲液（ReagentA）室温预热；反应液（ReagentB）和底物液（ReagentD）注意避光。然后进行下列操作。测定准备准备好待测样品（例如纯化线粒体样品等），置于冰槽里设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为600nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零背景对照测定移取780微升缓冲液（ReagentA）到新的比色皿加入100微升反应液（ReagentB）加入20微升底物液（ReagentD）上下倾倒数次，混匀放进30℃培养箱里静置3分钟加入100微升阴性液（ReagentC）上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：600波长读数0分钟－600波长读数1分钟或5分钟样品活性测定移取780微升缓冲液（ReagentA）到新的比色皿加入100微升反应液（ReagentB）加入20微升底物液（ReagentD）上下倾倒数次，混匀放进30℃培养箱里静置3分钟加入100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白）上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）即刻放入分光光度仪检测，此为样品活性读数：600波长读数0分钟－600波长读数1分钟或5分钟计算样品活性【（样品读数－背景读数）X1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数】÷【0.1（样品容量；毫升）X21.8（毫摩尔吸光系数X1或5（反应时间；分钟）】＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克单位＝微摩尔二氯酚靛酚/分钟
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