elisa细胞裂解的方法
- 上传人： 上海恒远ELISA试剂盒供应商 |大小：24KB|浏览：2199次|时间：2018-11-15
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对于培养细胞样品：1.融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的Z终浓度为1mM。2.对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍（如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗）。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。3.充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。对于组织样品：1.把组织剪切成细小的碎片。2.融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的Z终浓度为1mM。3.按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。（如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。）4.用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。5.充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。6.如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。注：RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。上海恒远生物科技有限公司主营产品/服务:ELISA试剂盒，免疫组化试剂盒，放免试剂盒，标准品，血清，抗体，培养基，细胞，生物试剂，实验耗材等服务承诺：1.所购产品均质量保证，有任何质量方面的问题，一律免费包换！2.试剂盒方面全程提供技术指导，还有免费代测的服务！3.本公司出售的任何产品均提供完善的售后服务，客户有任何疑问，均是一个工作日，给出解决方案！欢迎联系，联系电话：021-60515410,18221290082！
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