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ELISA的概念、原理、操作步骤

上传人: 上海恒远ELISA试剂盒供应商 |大小:34.5KB|浏览:1504次|时间:2018-11-15
ELISA的概念、原理、操作步骤
文档简介

ELISA的概念、原理、操作步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来,发展十分迅速,目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。  (一) 原理  ELISA是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的GX催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中,通过不同的设计,具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。  (二) 操作步骤方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:  1. 包被:用0.05MPH9.碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。  2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。  3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小时,洗涤。  4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。  5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。  6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。  方法二 用于检测未知抗体的间接法:   1、用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃过夜。2、次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。同时做空白、阴性及阳性孔对照于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育30-60分钟,洗涤,Z后一遍用DDW(超纯水)洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。3. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。4. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。5. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。(三) 试剂器材  1. 试剂  (1) 包被缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液):    NaCO31.59克 NaHCO3 2.93克  加蒸馏水至1000ml  (2) 洗涤缓冲液(PH7.4PBS):0.15M KH2PO40.2克 Na2HPO412H2O 2.9克 NaCl8.0克KCl0.2克Tween-200.05%0.5ml加蒸馏水至1000ml  (3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA)0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5~10%使用。  (4) 终止液(2MH2SO4):蒸馏水178.3ml,逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。  (5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸柠檬酸):0.2MNa2HPO4(28.4克/L)25.7ml 0.1M柠檬酸(19.2克/L)24.3ml 加蒸馏水50ml。  (6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml底物缓冲液(PH5.5)10ml0.75%H2O2 32μl  (7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5)1ml 3%H2O2 2μl  (8) 抗原、抗体和酶标记抗体。  (9) 正常人血清和阳性对照血清。  2. 器材:  (1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔,ELISA检测仪,50μl及100μl加样器,塑料滴头,小毛巾,洗涤瓶。  (2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。  (3) 4℃冰箱,37℃孵育箱。(四) 注意事项  1. 正式试验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件,待检样品应作一式二份,以保证实验结果的准确性。有时本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。  2. 在ELISA中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括:  (1) 固相载体的选择:许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。  (2)包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0~9.6之间。吸附温度,时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18~24小时。蛋白质包被的Z适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后,在其它试验条件相同时,观察阳性标本的OD值。选择OD值Zda而蛋白量Z少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1~10μg/ml。  (3) 酶标记抗体工作浓度的选择:首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。  (4) 酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应,而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用,应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间,以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制,尤其是H2O2在临用前加入。ELISA相关仪器试剂设备酶标仪洗板机化学发光检测仪ELISA检测试剂盒ELISPOT检测ELISA试剂盒抗体酶标板
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