细胞PTEN活性定磷比色法定量检测试剂盒产品说明书

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细胞PTEN活性定磷比色法定量检测试剂盒产品说明书主要用途细胞PTEN活性定磷比色法定量检测试剂是一种旨在使用特异性合成底物磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），在PTEN去磷酸化后，释放出游离磷酸根，与孔雀绿染料发生显色反应后，采用比色法测定其峰值的变化，以此进行测算单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细胞裂解悬液样品的PTEN活性及其YZ剂的检测。广泛应用于细胞凋亡、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。技术背景细胞张力蛋白同源在10号染色体缺失性磷酸酶（phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometen；PTEN；EC3.1.3.67），又称为多发性晚期肿瘤突变基因1（mutatedinmultipleadvancedcancers1；MMAC1），是一个肿瘤YZ基因，位于染色体10q23.3，转录产物515kb，蛋白产物175氨基酸。PTEN蛋白含有一酪蛋白磷酸酶的功能区和约175个氨基酸左右的与骨架蛋白张力蛋白（tenasin）、辅助蛋白（auxilin）同源的区域，是一种双重特异性磷酸酶，能使酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酯酰肌醇（phosphoinositide）等去磷酸化。PTEN具有调节细胞周期、防止细胞过度生长和分开裂解、参与细胞凋亡、粘附、迁移、浸润，控制细胞内磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate；PIP3）水平，调控Akt/PKB信号通路等功能。PTEN基因突变和缺失将导致肿瘤发生、发展和转移，以及多发性错构瘤综合征（Cowdensyndrome）等。基于底物磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸，在PTEN的催化下，水解产生磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），同时释放出游离磷酸根，进而与孔雀绿染料发生显色反应产生其峰值的变化（660nm波长），以此测算PTEN的活性。产品内容清理液（ReagentA）120毫升裂解液（ReagentB）10毫升缓冲液（ReagentC）1毫升阴性液（ReagentD）1毫升反应液（ReagentE）200微升终止液（ReagentF）1毫升显色液（ReagentG）4毫升标准液（ReagentH）500微升产品说明书1份保存方式保存裂解液（ReagentB）、缓冲液（ReagentC）、反应液（ReagentE）和显色液（ReagentG）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；终止液（ReagentF）和显色液（ReagentG）具有腐蚀性，避免直接用手接触；显色液（ReagentG）避免光照，有效保证6月用户自备15毫升离心管：用于样品处理的容器1.5毫升离心管：用于样品处理和保存的容器细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离（微型）台式离心机：用于样品收集培养箱：用于孵育反应物比色皿：用于比色的容器分光光度仪：用于比色分析实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液放进冰槽里融化。然后进行下列操作。样品准备准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（5X106细胞）小心加入3毫升预冷的清理液（ReagentA），覆盖生长表面小心抽去清理液使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞加入3毫升清理液（ReagentA），混匀细胞移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g小心抽去上清液加入500微升裂解液（ReagentB），充分混匀转移到预冷的1.5毫升离心管QL涡旋震荡15秒置于冰槽里孵育30分钟放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf5415）小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管移取2微升进行蛋白定量测定（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HL30030.1）即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作二、测定准备准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：样品须澄清）设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为660nm，并置零准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管按下表分别加入阴性液（ReagentD）和标准液（ReagentH）到每个离心管，混匀将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表管号阴性液（ReagentD）标准液（ReagentH）测定体系标准磷浓度10100微升20微摩尔/升225微升75微升15微摩尔/升350微升50微升10微摩尔/升475微升25微升5微摩尔/升5100微升00标准曲线测定移取20微升阴性液（ReagentD）到新的比色皿加入5微升上述配制的标准液在37℃温度下孵育10分钟加入8微升终止液（ReagentF），混匀加入100微升显色液（ReagentG），混匀室温下静置15分钟，避免光照即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数重复实验步骤1至7四次构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（A）；横座标（X轴）为标准磷浓度（微摩尔/升）样品背景测定移取20微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿加入5微升待测样品（总量100微克细胞裂解萃取液蛋白）在37℃温度下孵育10分钟加入8微升终止液（ReagentF），混匀加入100微升显色液（ReagentG），混匀室温下静置15分钟，避免光照即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数根据标准曲线获得样品背景对应磷浓度样品活性测定移取10微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿加入5微升待测样品（总量100微克细胞裂解萃取液蛋白）在37℃温度下孵育2分钟加入10微升反应液（ReagentE）在37℃温度下孵育10分钟加入8微升终止液（ReagentF），混匀加入100微升显色液（ReagentG），混匀室温下静置15分钟，避免光照即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数根据标准曲线获得样品活性对应磷浓度计算样品活性{[根据标准曲线获得样品活性对应磷浓度（微摩尔/升）根据标准曲线获得样品背景对应磷浓度（微摩尔/升）]X5（体系倍数）X样品稀释倍数}÷10（反应时间；分钟）＝纳摩尔磷/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔磷/毫克/分钟注意事项本产品为25次操作，包括5次标准测定操作时，避免污染母液操作时，须戴手套终止液（ReagentF）和显色液（ReagentG）具有腐蚀性，避免直接用手接触样品切忌使用磷酸缓冲液和脱氧胆酸纳处理比色测定后，比色皿须清洗彻底如果用户没有660nm波长，可以使用600至660nm的任一波长替代显示绿色表明具有较强酶活性空白对照读数应小于0.2建议待测样本蛋白浓度为100微克/5微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；（本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HL30030.1）钙调神经磷酸酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH8.0的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）释放1微摩尔的磷本公司提供系列磷酸化酶检测试剂产品质量标准本产品经鉴定性能稳定本产品经鉴定检测准确
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