荧光定量pcr

将荧光基团加入到PCR反应体系中，通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现，再根据标准曲线定量分析未知模板的方法，即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中，实时检测全程PCR扩增过程，按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。

技术原理

混合模板DNA和有荧光素的Taqman探针，遵守聚合酶链反应规律使高温变性，低温复性，适温延伸的热循环完成，切断和模板DNA互补配对的Taqman探针，荧光素在反应体系中游离。荧光在特定光激发下发出，被扩增的目的基因片段随着循环次数的增加呈指数级增长，Ct值根据实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度求取出来，同时对照多个已知模板浓度的标准品，就能够使待测标本目的基因的拷贝数得出。

荧光化学分方法

实时荧光定量常用的荧光化学分为有Tag Man探针法和SYBR Green I法两类。

1.TaqMan探针法

TaqMan 探针法是具有高度特异性的定量PCR技术。它的工作原理为有一对 PCR 引物和一条探针存在于PCR 反应体系中，有荧光淬灭基团存在于3′ 端标记，有报告基团存在于探针的5′ 端标记，探针仅和模板特异结合，两条引物之间是其结合点。因此信号仪器搜集不到，伴随反应的进展，Taq酶遇到探针，探针在外切核酸酶的活性的作用下被切断，从而造成淬灭基团不能吸收基团的荧光能量，从而使荧光信号产生，所以模板 DNA 的拷贝数取决于信号的强度。

2.SYBR Green I法

SYBR Green I为一种具有绿色激发波长的染料，其发射波长Zda约为 520 nm，Zda吸收波长约为 497 nm，能够结合所有的双螺旋小沟区域。由于处于游离状态，SYBR Green I发出的荧光较弱，然而其结合双链 DNA之后，就会使得荧光大大增强，

荧光信号的增加完全同步PCR 产物的增加。这个方法的优点是其能够对所有dsDNA 序列的扩增进行监测，

将荧光基团加入到PCR反应体系中，通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现，再根据标准曲线定量分析未知模板的方法，即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中，实时检测全程PCR扩增过程，按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。

三个阶段

1.荧光背景信号阶段

在该阶段，不能区分背景和扩增的荧光信号，不能对产物量的变化进行判断。

2.荧光信号指数扩增阶段

PCR产物量的对数值和起始模板量的线性关系仅仅在荧光累积进入指数阶段才存在，因此，在PCR反应在指数阶段来对PCR产物的量进行检测，通过此将模板Z初的含量推断出从而进行定量分析。由研究可知，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越少，则Ct值越大。由已知起始拷贝数的标准品能够将标准曲线获得，仅需将未知样品的Ct值得到，就能够根据标准曲线将该样品的起始拷贝数计算出来。

3.平台期

在平台期，扩增产物指数级的增加不再存在，因此反应终产物量与起始模板量之间也不存在。起始DNA拷贝数也不能够根据反应终产物计算出来。

检测方法

1.TaqMan探针法

当探针完整时，淬灭基团吸收报告基团发射的荧光信号。PCR扩增时，探针在Taq酶的5’-3’外切酶活性作用下酶切降解，分离开了淬灭荧光基团和荧光基团，从而使荧光信号能够被荧光监测系统接收到。也就是每有一条DNA链扩增，就会形成一个荧光分子，使PCR产物的形成与荧光信号的累积的完全同步实现。

2.SYBRGreenⅠ法

在PCR反应体系中，将过量SYBR荧光染料加入，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，将荧光信号发射出来，而不掺入链中的SYBR染料分子不会有任何荧光信号发射出来，从而使PCR产物的增加和荧光信号的增加得到保证。

将荧光基团加入到PCR反应体系中，通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现，再根据标准曲线定量分析未知模板的方法，即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中，实时检测全程PCR扩增过程，按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。

两个概念

1.Ct值

t代表threshold，C代表Cycle，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，即为Ct值的含义。

2.荧光域值(threshold)的设定

荧光本底信号为PCR反应的前15个循环的荧光信号，3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍为荧光域值的缺省设置。

传统定量只能终点检测的不足之处，通过实时荧光定量PCR技术可以将其有效的解决，使得荧光信号的强度每一轮循环就能够检测一次并且在电脑上记录下来得以实现。在电脑软件之中，通过计算每个样品Ct值，按照标准曲线就能将定量结果得到。所以基于如下两点，实时荧光定量PCR可以不需要内标。

a.Ct值与起始模板的线性关系

因为Ct值与起始模板的对数存在线性关系，未知样品的定量测定能够根据标准曲线。所以实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

b.Ct值的重现性

PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，真正的指数扩增期（对数期）刚刚进入，这个时间误差很小，还没有被放大，所以Ct值有极好的重现性，也就是时间相同不同管内扩增或者不同时间相同模板扩增，会得到相同的Ct值。

特点

1.重复性好

2.检测速度快

3.自动化程度高

4.特异性强

5.灵敏度高

实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性高和精确性高的优点，此项技术已被应用于分子生物学、医学、食品检测和环境监测等多个领域。

在食品检测方面的应用

1.转基因

利用荧光定量PCR技术扩增放大转基因信号。

2.微生物

食品安全和人民群众的生活息息相关，在生产、储藏、运输、销售等一系列过程中，食品会受到来自微生物的污染。食品中的致病菌可以通过荧光定量PCR技术来检测。

在环境监测方面的应用

河流中环境微生物随着季节变化的情况能够通过实时荧光定量PCR技术被检测出来，地表水和饮用水中致病菌也可以通过实时荧光定量PCR技术进行检测。

在分子生物学领域的研究应用

1.用于单核苷酸多态性(SNP)检测分析

不同人群对疾病的易感性和对同一种药物ZL同一种疾病的效果也不形同，个体差异的遗传是基于遗传物质DNA的多态性RELP，STR，ABO血型和SNP。SNP广泛地存在于人类基因组中，为Z常见的一种人类可遗传变异，对于遗传性疾病的研究具有重要的意义。

2.DNA甲基化检测

表观遗传学重要的标记信息为DNA甲基化，对于表观遗传学的时空特异性研究来说，由实时荧光定量PCR技术将基因组甲基化水平数据得到具有重要意义。

3.定量核酸浓度

核酸浓度测定的传统方法是使用分光光度计或琼脂糖凝胶电泳，测定的结果不仅不够精确而且容易受到污染。上述的问题通过实时荧光定量PCR就能够解决，实时荧光定量PCR具有很高的准确性和灵敏度并且没有污染。该技术是定量分析某些传染性疾病和检测病原微生物和病毒的shou选。

4.研究基因表达

基因时间、空间表达水平差异的比较能够应用实时定量PCR技术。

在医学领域的研究应用

1.用于病原体检测

定量常规PCR做不到，在操作中容易受到污染从而使假阳性结果出现，然而该问题应用实时荧光定量PCR技术能够解决。提供疾病的诊断和ZL依据、抗结核药物ZL后病人痰样本病原体DNA含量的定量检测、丙肝病毒、宫颈癌及其癌前病变有关

将荧光基团加入到PCR反应体系中，通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现，再根据标准曲线定量分析未知模板的方法，即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中，实时检测全程PCR扩增过程，按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。

注意事项

1.操作规范

需要规范样品核酸提取和实时荧光扩增时的操作，避免样品交叉污染， 酶被降解，出现假阳性的情况。

（1）根据试验的分区严格操作，按照提取区、扩增区、检测区单方向流动，不能够逆向流动物品、样品和试剂。 

（2）在对多份样品进行操作的时候，制备反应混合液，首先混合好荧光PCR反应液、荧光探针和酶。之后在每个PCR管中进行分装，如此不仅会使操作次数减少，而且能够使污染避免，还能够使反应的精确度增加。

（3）在对样品和蛋白酶k添加的过程中，要对避免酶的降解和样品的交叉污染尤其留心。

（4）在操作的时候，需要将阴性及阳性对照设立，能够对荧光PCR反应的准确性和可信性进行验证。

（5）使用的离心管、枪头和PCR 管需要确保没有污染，或者将它们进行高压灭菌。

（6）在完成核酸的提取之后应当立刻进行仪器的扩增，不能够在室温环境下过长时间放置提取的核酸，空气中的酶能够轻易的将其降解，其可以在－70 ℃冰箱内长期保存，在 －20 ℃冰箱内短期保存。

（7）因为产物气溶胶或标本 DNA 会很容易对移液器造成污染，所以需要使用可高压处理的移液器。

2.温度设置

在对荧光 PCR 程序进行设置的时候，应当需对程序中的目标温度、恒温时间和循环次数等参数仔细的核对，PCR 检测结果会受到不正确的参数设置的影响。延伸过程中，需要对荧光信号的读取收集进行设置。如果不对收集荧光进行设置，那么试验数据将无法保存，检测结果将没有办法判定，从而导致试验失败。

3.仪器摆放

放置实时荧光定量 PCR 仪的台面应当平稳，离水池较远，少灰，干燥，不能有强光直射，室内应当