简介

将高通量自动化用于连续微波多肽固相合成（SPPS）为多肽生产提供了显着优势。可以更高的纯度、更少的浪费和极快的速度每批次合成多达 24 种肽。与平行方法相比，批次中的单个肽可以方便地进行分析和纯化，而无需等待整个批次完成。在 Liberty PRIME™ 2.0 HT24 上展示了自动连续微波 SPPS 的使用，可快速生产 20 种不同的 16 个氨基酸组成的新生抗原肽。 

介绍

现代肽研究是快节奏的，通常需要筛选肽库以发现和开发功能 性多肽。自动化的微波辅助 SPPS 大大减少了合成多肽所需的时间，但如果需要准备文库，则每次合成一个肽需要用户在每个合成之间输入序列。CEM 的微波多肽合成仪（Liberty™ 2.0、Liberty Blue™ 2.0 和 Liberty PRIME™ 2.0）可与 HT 自动树脂装载配合，允许用户排列并自动连续合成多达 24 个多肽。对于队列中的每个多肽，成批的单个树脂被预加载到 HT 上，然后自动转移到 Liberty 合成仪进行肽合成。

自动树脂转移无需用户在每个排队的肽之间输入，从而最 大限度地提高工作日的生产力，并允许多个肽合成过夜运行。HT 自动树脂装载模块设计用于根据合成器的循环时间，理想条件下能在一个队列中传输 4、12 或 24 批树脂。根据研究人员的需要，最快的合成器 Liberty PRIME 2.0 可以配备 HT4、HT12 或 HT24。Liberty Blue 2.0 可配备 HT4 或 HT12，而基本型号 Liberty 2.0 可配备 HT4。此外，Liberty PRIME 2.0 合成器配置有HT24时，可容纳额外的试剂和试剂瓶，在无需重新填充的条件下运行大批量合成，并且具有在 cGMP 标准下用于肽生产可选配置。

为了证明，使用配置有 HT24 的 Liberty PRIME 2.0 合成了一组 20 种已发表的新抗原肽，它们具有不同的序列，平均长度为 16 个氨基酸残基。这组肽的总合成时间为 24 小时 14 分钟。使用 CarboMAX™ 以 0.1 mmol 规模合成肽，得到的粗肽纯度为 47%–90%，平均纯度为 69%（表1和图1）。总 DMF 的使用量为 6056 mL，产生的废物总量为 6979 mL（表 2）。这些新抗原肽通过高温色谱法进一步纯化至适合生物学研究的纯度。 

材料和方法

试剂

以下 Fmoc 氨基酸购自 CEM Corporation (Matthews, NC) 并含有指定的侧链保护基团：Ala、Asn (Trt)、Arg (Pbf)、Asp (OMpe)、Cys(Trt)、Gln(Trt) 、Glu(OtBu)、Gly、His(Boc)、Ile、 Leu、Lys(Boc)、Pro、Met、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)、Tyr( tBu) 和 Val。Rink Amide ProTideTM LL 树脂（离子交换容量 0.20 meq/g ）也购自 CEM Corporation。N,N'-二异丙基碳二亚胺 (DIC)、吡咯烷、三氟乙酸 (TFA)、3,6-二氧六环-1,8 辛二硫醇 (DODT) 和三异丙基硅烷 (TIS) 购自 Sigma-Aldrich (St. Louis,  MO)。二氯甲烷 (DCM)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、无水乙 醚 (Et2O) 和乙酸购自 VWR (West Chester, PA)。LC-MS 级水 (H2O) 和 LC-MS级乙腈 (MeCN) 购自 Fisher Scientific (Waltham, MA)。 

多肽合成

使用 CEM Liberty PRIME 2.0 自动微波肽合成仪在 Rink Amide ProTide 树脂 LL 上所有肽以 0.1 mmol 的规模合成。用吡咯烷在 DMF 中进行脱保护。在 DMF (CarboMAX) 中使用 5 倍当量的 Fmoc-氨基酸与 DIC 和 Oxyma Pure 进行偶联反应。使用 TFA/ H2O/TIS/DODT 在 38 °C 下进行裂解。裂解后，用无水乙 醚沉淀多肽并过夜冻干。 

多肽分析

在配备有 Acquity UPLC BEH C8 色谱柱 (1.7 mm x 100 mm) 和 Q Exactive plus MS 的 ThermoFisher UPLC 系统上分析多肽。峰图分析是在 Chromeleon 软件上完成的。使用 (i) H2O 和 (ii) MeCN 中的 0.05% TFA 梯度洗脱进行分离。 

结果

表1.使用带有 HT24 的 Liberty PRIME 2.0 上连续合成获得多肽各自的序列和粗纯度。

结论

使用 HT 树脂传输模块的自动顺序微波 SPPS 为大批量多肽的合成提供了强大的设备。仅在一天内完成 20 种不同新抗原肽的高纯度批量合成。单个多肽合成在大约 1 小时内完成，纯度高，产生的废物极少。该批次中的所有多肽都能够使用 Prodigy 系统的高温制备 HPLC 以高产率快速纯化。HT 自动树脂装载模块 （ HT4、 HT12、 HT24 为 Liberty 2.0、Liberty Blue 2.0 和 Liberty PRIME 2.0 微波肽合成仪提供了强 力的升级。

参考文献

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