原位杂交-典型实验方案背景

复水（有时候也用到脱水，只是顺序相反）

温度：环境

描述：通过一系列的缓冲液交换将样品从在100% 甲醇或乙醇的储存条件中转移到水缓冲液中。通常从100%的乙醇交换到75%、50%、25%、0%，每次交换后留5 min进行平衡即可。如脱水进行太快或不进行脱水，样品形态将被破坏，甚至被撕成碎片。

漂白（可选）

温度：环境

描述：通常与3%的过氧化氢孵育，以摆脱内部的过氧化物酶和漂白暗色的胚胎

烷基化（可选，INTAVIS仪器不能完成）

温度：环境

描述：三乙醇胺中的乙酸酐用于使组织带负电荷，从而降低背景。它被广泛应用，特别是在植物领域，用极少的探针就可以增强结果。

自动化时：乙酸酐在溶液中非常不稳定，它在制备后能用于孵育的时间不超过一分钟，因此不可能实现自动化（并且探针通常不需要）。

细胞壁消化（可选，只在植物中）

温度：环境

描述：植物样品中主要使用盐酸水解细胞壁。或者如崩溃酶和纤维素酶等酶类也能被使用。

渗透（时间要求严格）

温度：环境或37℃

描述：使探针能接触样品组织至关重要。这步处理通常使用蛋白酶，主要是蛋白酶K，但链霉蛋白酶和其他蛋白酶也能被使用。但也有其他的处理方法，如热处理（蒸汽）或与洗涤剂混合物孵育。对于蛋白酶K，甘氨酸通常被用来立即停止蛋白酶K的作用，或者通过数次换液将蛋白酶K 洗掉。渗透后，通常会使用多聚甲醛进行固定。

自动化时：所有蛋白酶应足够稳定，到使用前不会自我分解，如蛋白酶K。

杂交

温度：通常50-70℃（RNAse 在37℃）

描述：杂交由几步组成：

1. 预杂交步骤（可选）逐步交换杂交 缓冲液，并封闭非特异结合位点

2. 杂交步骤，与探针孵育

3. 杂交后洗涤步骤，用越来越严格的缓冲液进行多次洗涤

4. 通常在杂交后洗脱步骤之间，进行RNAse消化（可选）来摆脱未结合的探针减少背景：RNAse缓冲液洗涤，用RNAse处理，再次RNAse缓冲液洗涤，所有步骤在37℃进行。

5. 更多的杂交后洗涤

抗体孵育

温度：环境或更低

描述：

在此步骤中，抗体与探针上的抗原结合

1. 用封闭试剂封闭（如Roche 封闭试剂，BSA，山羊或绵羊血清）。在这一步，所有非特异抗体结合位点将被蛋白饱和

2. 与抗体孵育，让抗体抗原结合

3. 洗涤步骤，洗涤未结合抗体

自动化时：由于基本上所有检测探针的抗体都是商业化的，它们室温下工作并具有相同的特异性。抗体结合在室温下更快结合。

与碱性磷酸酶缓冲液孵育（如NTMT）

温度：环境

描述：与新鲜制备的缓冲液孵育，为碱性磷酸酶颜色反应做准备

自动化时：使用碱性磷酸酶偶联抗体时，缓冲液储存过久或使用前制备时会沉淀。