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解决方案
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高通量自动化微波增强多肽合成
发布:培安(中国)有限公司浏览次数:386简介 将高通量自动化用于连续微波多肽固相合成(SPPS) 为多肽 生产提供了显着优势。 可以更高的纯度、更少的浪费和极快 的速度每批次合成多达 24 种肽。 与平行方法相比,批次中的 单个肽可以方便地进行分析和纯化,而无需等待整个批次完 成。 在 Liberty PRIME™ 2.0 HT24 上展示了自动连续微波 SPPS 的使用,可快速生产 20 种不同的 16 个氨基酸组成的 新生抗原肽。
介绍 现代肽研究是快节奏的,通常需要筛选肽库以发现和开发功能 性多肽。 自动化的微波辅助 SPPS 大大减少了合成多肽所需的时间,但如果需要准备文库,则每次合成一个肽需要用户在每个合成之间输入序列。 CEM 的微波多肽合成仪(Liberty™ 2.0、Liberty Blue™ 2.0 和 Liberty PRIME™ 2.0)可与 HT 自动树脂装载配合,允许用户排列并自动连续合成多达 24 个多肽。 对于队列中的每个多肽,成批的单个树脂被预加载到 HT 上,然后自动转移到 Liberty 合成仪进行肽合成。 自动树脂转移无需用户在每个排队的肽之间输入,从而蕞大限度地提高工作日的生产力,并允许多个肽合成过夜运行。 HT 自动树脂装载模块设计用于根据合成器的循环时间,理想条件下能在 一个队列中传输 4、12 或 24 批树脂。 根据研究人员的需要, 最快的合成器 Liberty PRIME 2.0 可以配备 HT4、HT12 或 HT24。 Liberty Blue 2.0 可配备 HT4 或 HT12,而基本型号 Liberty 2.0 可配备 HT4。 此外,Liberty PRIME 2.0 合成器配置 有HT24时, 可容纳额外的试剂和试剂瓶,在无需重新填充的条 件下运行大批量合成,并且具有在 cGMP 标准下用于肽生产可选 配置。 为了证明,使用配置有HT24的 Liberty PRIME 2.0 合成了一组 20 种已发表的新抗原肽 1、2,它们具有不同的序列,平均长度为 16 个氨基酸残基。 这组肽的总合成时间为 24 小时 14 分钟。 使用 CarboMAX™ 以 0.1 mmol 规模合成肽,得到的粗肽纯度为 47% – 90%,平均纯度为 69%(第 2 页的表 1 和第 3 页的图 1)3。总 DMF 的使用量为 6056 mL,产生的废物总量为 6979 mL(第 2 页 表 2)。 这些新抗原肽通过高温色谱法进一步纯化至适合生物学 研究的纯度4。
材料和方法
试剂 以下 Fmoc 氨基酸购自 CEM Corporation (Matthews, NC) 并含有 指定的侧链保护基团:Ala、Asn (Trt)、Arg (Pbf)、Asp (OMpe)、Cys(Trt)、Gln(Trt) 、Glu(OtBu)、Gly、His(Boc)、Ile、 Leu、Lys(Boc)、Pro、Met、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)、Tyr( tBu) 和 Val。 Rink Amide ProTideTM LL 树脂(离子交换容量 0.20 meq/g )也购自 CEM Corporation。 N,N'-二异丙基碳二亚 胺 (DIC)、吡咯烷、三氟乙酸 (TFA)、3,6-二氧六环-1,8 辛二硫醇 (DODT) 和三异丙基硅烷 (TIS) 购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。 二氯甲烷 (DCM)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、无水乙mi (Et2O) 和乙酸购自 VWR (West Chester, PA)。 LC-MS 级水 (H2O) 和 LC-MS级乙腈 (MeCN) 购自 Fisher Scientific (Waltham, MA)。
多肽合成 使用 CEM Liberty PRIME 2.0 自动微波肽合成仪在 Rink Amide ProTide 树脂 LL 上所有肽以 0.1 mmol 的规模合成。 用吡咯烷 在 DMF 中进行脱保护。 在 DMF (CarboMAX) 中使用 5倍当量的 Fmoc-氨基酸 与 DIC 和 Oxyma Pure 进行偶联反应。 使用 TFA/ H2O/TIS/DODT 在 38 °C 下进行裂解。 裂解后,用无水乙mi沉淀多肽并过夜冻干。
多肽分析 在配备有 Acquity UPLC BEH C8 色谱柱 (1.7 mm x 100 mm) 和 Q Exactive plus MS 的 ThermoFisher UPLC 系统上分析多 肽。 峰图分析是在 Chromeleon 软件上完成的。 使用 (i) H2O 和 (ii) MeCN 中的 0.05% TFA 梯度洗脱进行分离。
结果 表 1 .使用 带有HT24 的 Liberty PRIME 2.0 上连续合成获得 多肽各自的序列和粗纯度。
结论 使用 HT 树脂传输模块的自动顺序微波 SPPS 为大批量多肽的合成 提供了强大的设备。 仅在一天内完成 20 种不同新抗原肽的高纯度批量合成。单个多肽合成在大约 1 小时内完成,纯度高,产生的废物极少。 该批次中的所有多肽都能够使用 Prodigy 系统的高温制备 HPLC 以高产率快速纯化4。HT 自动树脂装载模块 ( HT4、 HT12、 HT24 为 Liberty 2.0、Liberty Blue 2.0 和 Liberty PRIME 2.0 微波肽合成仪提供了qiang力的升级。
参考文献 1. Hilf, N.; Kuttruff-Coqui, S.; Frenzel, K.; Bukur, V.; Stevanovic, S.; Gouttefangeas, C.; Platten, M.; Tabatabai, G.; Dutoit, V.; van der Burg, S. H.; Thor Straten, P.; Martínez-Ricarte, F.; Ponsati, B.; Okada, H.; Lassen, U.; Admon, A.; Ottensmeier, C. H.; Ulges, A.; Kreiter, S.; von Deimling, A.; Skardelly, M.; Migliorini, D.; Kroep, J. R.; Idorn, M.; Rodon, J.; Piró, J.; Poulsen, H. S.; Shraibman, B.; McCann, K.; Mendrzyk, R.; Löwer, M.; Stieglbauer, M.; Britten, C. M.; Capper, D.; Welters, M. J. P.; Sahuquillo, J.; Kiesel, K.; Derhovanessian, E.; Rusch, E.; Bunse, L.; Song, C.; Heesch, S.; Wagner, C.; Kemmer-Brück, A.; Ludwig, J.; Castle, J. C.; Schoor, O.; Tadmor, A. D.; Green, E.; Fritsche, J.; Meyer, M.; Pawlowski, N.; Dorner, S.; Hoffgaard, F.; Rössler, B.; Maurer, D.; Weinschenk, T.; Reinhardt, C.; Huber, C.; Rammensee, H.-G.; Singh-Jasuja, H.; Sahin, U.; Dietrich, P.-Y.; Wick, W., Actively personalized vaccination trial for newly diagnosed glioblastoma. Nature 2019, 565 (7738), 240-245. 2. Zitterbart, R.; Berger, N.; Reimann, O.; Noble, G. T.; Lüdtke, S.; Sarma, D.; Seitz, O., Traceless parallel peptide purification by a first-inclass reductively cleavable linker system featuring a safety-release. Chem. Sci. 2021, 12 (7), 2389-2396. 3. CEM; CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperatures. CEM Corporation Website, Application Notes. [Online]. Published Online: January 9, 2018. https://cem.com/en/carbomax-enhanced-peptide-coupling-at-elevated-temperatures (accessed April 22, 2022). 4. CEM; Prodigy - Enhanced Peptide Purification at Elevated Temperature. CEM Corporation Website, Application Notes.
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