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Multitron CHO 细胞培养

发布:北京桑翌实验仪器研究所
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1. 简介

摇瓶的使用对动物细胞的培养越来越重要。以下各种摇瓶中培养CHO(ZG仓鼠卵巢)细胞的示例表明,Multitron细胞培养摇床(INFORS HT,CH Bottmingen)非常适合种子液的生产。

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CHO细胞系是生物技术中常用的细胞系。为了生产用于接种的种子培养液和生产SEAP蛋白,使用了CHO-XM-111细胞株。瑞士苏黎世联邦理工学院 M.Fussengerger 教授的团队用编码重组蛋白SEAP(分泌型碱性磷酸酶)基因的表达载体转染该细胞株,并使用由四环素控制的启动子PhCMV-1。表达载体的使用使得通过启动子可选择性表达两个基因成为可能。这样就可以生产SEAP蛋白,包括非生产性的生长阶段,和基于无四环素培养基交换的增殖YZ生产阶段。


2. Multitron 技术参数

*  50 mm 振幅 (可选25mm)

*  通气 空气和  CO2 (0 – 20% asstandard)

*  蒸汽湿度套件(可选)

*  不同可选托盘 (一次培养袋托盘, 粘性托盘,通用托盘等)

*  其他选项 (制冷, 去污, ShakerBag等)


3. 实验条件

为了在生物反应器中生产种子培养液(作为后期培养的接种物)和SEAP,使用CHO-XM-111细胞系,无血清和无蛋白的HP-1培养基(Cell Culture Technologies GmbH)在250 mL、500 mL和1000mL摇瓶中进行培养。在培养基中添加2g/L Pluronic F-68(Sigma)和2.5 mg/L 四环素(Sigma)。设置温度37℃,湿度85% 和5%的CO2饱和度。所有摇瓶以恒定的122 rpm转速在Multitron(INFORS-HT, CH-Bottmingen)中培养。

 

4. 批次补料振荡培养

采用不同体积的摇瓶和相应的补料策略。

a) 在250ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行:

image.png

ZD比生长速率μmax为0.048 h-1,倍增时间td =14.4h。

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图1: Multitron

b) 在500ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行:

image.png

ZD比生长速率μmax为0.024 h-1,倍增时间td =28.9h。

c) 在1000ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行:

image.png

ZD比生长速率μmax为0.044 h-1,倍增时间td =15.65h。

d) 蒸汽加湿

为了检测每日液体损失,使用125 mL摇瓶,工作体积为15 mL、20 mL和25 mL,在温度为37°C,湿度为85% rH的培养前后测定总体积。


5. 分析

a)  参数分析

每天使用细胞计数器yc100(Chemotec)测定活细胞浓度。使用Bioprofile Analyzer 100 Plus(Nova Biomedical)完成生长和生产基质的分析。

b)公式                                                                                                                   

对于ZD生长速率μmax和倍增时间td的计算,使用以下公式。

image.png


6. 结果分析

为了优化CHO种子液培养,在Multitron细胞培养摇床中设置了三个不同体积的摇瓶(250ml、500ml和1000ml)。在培养CHO-XM-111细胞的同时,每天取样检测,从而可以z佳地比较细胞浓度、底物消耗和缓冲液。

对比ZD细胞浓度表明,500ml 摇瓶中的培养物每毫升可产生4.65×106个细胞。在所有培养物中,6天内可达到98%以上的存活率。通过优化补料策略,种子培养可在2天后进行,最多5天(图2)。

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图2:对比细胞浓度和活力

葡萄糖和谷氨酰胺的消耗量,尤其在500mL摇瓶中,表明底物在第五天之前是足够的,因此补料可防止底物限制(图3).

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图3:对比葡萄糖和谷氨酰胺

已知同时形成铵,乳酸和谷氨酸可降低细胞生长速率。在所有培养物中,在培养的第五天也观察到亚临界浓度的铵。此外,通气和连续供应5%的CO₂可以为培养系统提供ZJ缓冲,因此也可以提供合适的pH条件(图4)。

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图4:比较铵的含量,谷氨酸盐,乳酸和pH

直接蒸汽加湿对培养基损失有重要影响,同时也会改变渗透压。

特别是在小工作体积下,一天的ZD蒸发量小于0.4%。

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图5:125mL挥发量

摇瓶的工作体积对氧交换有很大影响,不应超过摇瓶最适工作体积。


7. 总结

培养2-5天后,细胞总数达到1.8 x 10⁸和1.4 x 10⁹之间。它可用作2.5L生物反应器的接种物,活细胞浓度约为每毫升5×10⁵。

接种细胞密度和细胞活力越高,培养过程中细胞密度越高。

尽早更换培养基

在较小接种量和补料策略允许的情况下,可额外补充细胞培养营养物质。另一方面,培养液被稀释,因此有毒产物减少。

在85%相对湿度条件下,蒸发量小于0.5%,可实现稳定的渗透压和工艺再现性。

摇瓶培养可用于进一步的工艺步骤,例如接种生物反应器或一次性袋。

2021-01-25
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