阴离子交换色谱法快速分析质粒拓扑异构体

前言

近年来，重组质粒DNA (pDNA) 被越来越多地用作基因ZL原料药 (例如: 用于生产慢病毒和AAV载体) 以及DNA疫苗的活性成分。药物级质粒DNA必须要符合宿主相关杂质、均一性方面的要求 (例如: pDNA拓扑异构体的含量: 共价闭环的超螺旋 (CCC)、开环 (OC) 和线型 (L) 以及二聚体或多聚体)。在大规模质粒发酵过程中，质粒主要以超螺旋形式存在。进入到下游工艺时，一些质粒可能会出现缺口，转化为开环和线型的形式。

在本篇推送中，我们将介绍一种使用阴离子交换色谱柱TSKgel DNA-NPR对pDNA样品进行快速、准确表征的HPLC分析法1)。并且，该方法可以非常容易地从HPLC转移到UHPLC系统。

1. 实验条件

实验中以pBR322 (DY种广泛使用的大肠杆菌克隆载体) 为例。质粒pBR322的长度为4361个碱基对，分子量为2.83×10⁶Da。为了正确分类拓扑异构体，我们用限制性单切酶EcoRI来孵育制备线型质粒。pBR322在位置4359处具有一个EcoR1限制性酶切位点。消化时，每μg DNA使用1单位的限制性内切酶。讲样品在37℃下孵育60分钟后，通过将温度提升至65℃并加热20分钟来终止反应。

2. 快速分离质粒拓扑异构体

图1是使用TSKgel DNA-NPR分析pBR322的色谱图。在5分钟的线性梯度下以1.0 mL/min流速分析质粒。3个洗脱峰代表了质粒的三种不同类型：超螺旋、开环和线型。其中，ZG峰对应超螺旋质粒。

图1. pBR322的AEX分离谱图

线型质粒的分析条件与超螺旋质粒相同。图2的单峰色谱图表示的是EcoR1消化后的线型质粒。图3是两个色谱图的叠加图。可以证实峰3对应了线型质粒。

图2. EcoR1消化后的线型pBR322的分离谱图

图3. 叠加图

3. 总结

TSKgel DNA-NPR离子交换色谱柱由2.5μm的亲水性无孔聚合物颗粒充填，颗粒表面采用弱阴离子交换基团修饰。无孔颗粒能够实现快速传质，这是实现高分辨率分离的关键因素。

使用TSKgel DNA-NPR能够简便、快速地区分出超螺旋、开环和线型三种不同形式的质粒DNA。该分析方法非常适用于药物级pDNA研发和生产的各个阶段，而且还可同时用于HPLC和UHPLC系统。

4. 参考文献

1.Characterization of Plasmid DNA Samples by Chromatographic Methods; Hermann Schuchnigg,Patricia Cantarell,Christoph Pollak,Jochen Urthaler,Wolfgang Buchinger;Boehringer Ingelheim Austria GmbH, Poster HPLC 2008,Baltimore,MD,USA