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重组腺相关病毒的IEC-HPLC分析法

发布:东曹(上海)生物科技有限公司
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腺相关病毒也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒,需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。

重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒,由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低,在体内表达外源基因时间长等特点,被视为最有前途的基因转移载体之一,在世界范围内的基因ZL和疫苗研究中得到广泛应用。

目前用于定量的标准生物分析方法需要3天的感染期和1天的分析时间,这成为快速工艺优化的主要障碍。本篇应用采用了强阳离子交换色谱法,建立了一种快速定量分析方法[1],分析时间可缩短到20 min以内。

1 样品制备

重组腺相关病毒2型 (rAAV-2) 参考方法[2]制备。


2 分析条件

色谱柱:TSKgel SP-NPR(4.6 mm I.D.×3.5 cm, 2.5 μm)

流动相A:50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl, 100 mM NaCl(pH 7.5)

流动相B:50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl, 500 mM NaCl(pH 7.5)

流速:1.0 mL/min

柱温:室温

检测器:UV@280 nm

样品:重组腺相关病毒2型(rAAV-2)

进样量:10-100 μL(1.0×1011DRP)


3 分析结果

001.png

图1. 纯化后rAAV-2载体分离色谱图

001.png

图2. rAAV-2载体校正曲线

结果与讨论

采用无孔强阳离子交换色谱柱TSKgel SP-NPR对重组腺相关病毒2型载体进行定量分析,实验结果表明,该方法可以在20分钟内完成一次分析。定量线性范围较宽 (1.0×1010-5.0×1011DRP, R2值0.997),可适用于稀释和浓缩样品的分析。收集流出峰紫外光谱与进样样品紫外光谱一致,感染率无明显变化,说明病毒载体分析后仍保留活性。该方法可广泛用于过程开发、基因ZL用重组腺相关病毒的纯化与分析。

TSKgel SP-NPR色谱柱采用了无孔的亲水性聚合物填料,表面键合有强阳离子交换基团,由于其粒径较小,可实现快速分离。该色谱柱尤其适合分析腺相关病毒,并且具有ji高的蛋白回收率。


参考文献:

1. D. Debelak, J. Fisher, S. Iuliano, D. Sesholtz, D. L. Sloane, E. M. Atkinson, J. Chromatogr. B, 740 (2000) 195-202.

2. K. R. Clark, F. Voulgaropoulou, D.M. Fraley, P.R. Johnson, Human Gene Ther. 6 (1995) 1329–1341.

2020-12-15
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