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机器人走进实验室系列(二)拓展篇:更快、更准、更稳,Andrew+实现抗体纯化和酶解自动化
发布:沃特世科技(上海)有限公司(Waters)浏览次数:151从细胞培养物等粗样品中亲和纯化mAb是治 疗性抗体工艺开发和生产过程中的标准程序。由于蛋白A选择性地与IgG抗体结合且具有高亲和力,因此蛋白A亲和纯化是一种广泛应用的纯化策略。磁珠凭借其易用性也成为一种常用的纯化介质。蛋白A偶联磁珠兼具蛋白A的高选择性以及从纯化样品中有效去除磁珠的优点。
下面小编向大家介绍,直接从细胞培养基中收获的治 疗性mAb进行纯化和酶解的全自动工作流程。该方法使⽤蛋白A磁珠进⾏纯化,然后进行酶解/还原的联合操作。利用 Andrew+移液机器人实现整个样品制备过程的自动化,得到可供 Waters BioAccord LC-MS系统分析的mAb亚基。
BioAccord LC-MS系统是一款飞行时间质谱仪,专为生物制药工艺和产品开发中的常规监测而设计,用于完整分子量、肽图、Peptide MAM多属性方法、游离N-糖、细胞培养基等的分析。
图1. 抗体纯化和酶解直至亚基LC-MS定量分析的完整工作流程(本次介绍Subunit analysis, 对于Glycan Profiling, Peptide Mapping的样品制备,Andrew+也有对应的自动化方案)。
优势
1、用于mAb纯化和酶解的全自动方案,8个样品并行处理需要2 h,48个样品大约需要3 h,但同样的制备过程手动执行至少要半天,约4 h。所以,自动执行mAb纯化和酶解可以比手动操作节省25% - 50%的时间。
2、基于浏览器的OneLab软件可在任何电脑/平板上运行,拖拽式操作,简单易上手,是真正能让分析人员学会用的自动化软件,无须编程背景。
3、该程序可用于制备低至0.5 μg的有限样品量和高达10 μg mAb的样品量,因此适合与微型生物反应器和更大规模的生物反应器装置配合使用。
在介绍该实验方案之前,让我们看一下蛋白A磁珠纯化和酶解会用到的3个高级装置。
实验方案
使用了未转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养基,培养了15天,进行了0.2 μm过滤,使用了Magne蛋白A磁珠。
表1. 用于mAb纯化和酶解的所有试剂和材料列表。
实验过程
图2. 使用蛋白A偶联磁珠进行抗体纯化的示意图。
本研究中,使用FabRICATOR (IdeS)蛋白酶在铰链下方的特定位点裂解抗体,然后通过DTT还原轻链与重链之间的⼆硫键,生成mAb亚基(大小为23 - 25 kDa)。亚基比完整的mAb更均⼀且质量数足够低,可以使用价格适中的MS仪器获得质量足够高的谱图,同时仍然提供相当短的分析时间和简化的数据解析。
图3. 使用Andrew+进行自动化抗体纯化和酶解,以及使用Waters BioAccord系统进行快速LC-MS分析的工作流程。
实验结果
纯化样品的LC-MS分析得到所有三个亚基的高质量谱图,可对不同修饰(如Fc糖基化)进行相对定量。未纯化的细胞培养物样品的直接LC-MS分析未得到适合分析的亚基。
利用手动方案(图4b)和Andrew+机器人方案(图4c)生成的蛋白A纯化和酶解的mAb的LC-MS结果相似,且所有平均亚基质量数与对照样品结果相当。
图4 . a-c. 进行纯化和酶解的mAb亚基的LC-MS分析结果;d. 未纯化酶解的mAb。
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2022-08-25 -
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