6种脂溶性维生素的快速检测方案

维生素是维持人体生命活动所必需的一类营养物质，大多数由食物供给，属于人体内的一类调节物质。维生素分为水溶维生素和脂溶维生素，脂溶性维生素是不溶于水而溶于脂类的一类维生素，在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要作用，包含维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。

VD在肝脏可转化为25羟基维生素D(25OH-VD)，其浓度水平与体内的VD直接相关，因此体内25OH-VD2、25OH-VD3可作为检测VD水平的生物标志物。VK是激活凝血因子以及蛋白质C和S的必须辅助因子，目前已知主要有K1、K2、K3、K4几种形式，四烯甲萘醌VK2(MK4)既是VK2的家族成员，也是肝外组织中K1的代谢物。当这些脂溶性维生素缺乏或过量时均会对人体造成伤害。具体见下表：

一次性评估体内多种维生素水平，才能全面“查漏补缺”。准确测定人体中性维生素的含量，可以帮助临床医生准确评估人体维生素营养状态、吸收障碍或毒性水平。

解决方案

沃特世团队依托质谱平台ACQUITY UPLC I-Class Xevo TQ-S IVD和 TQ-XS IVD开发了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术在维生素检测中的应用，在5 min内即可完成6种脂溶性维生素的同时分析。前处理采用Andrew Alliance机器人搭配Oasis μElution PRiME HLB的固相萃取板，实现样本前处理自动化，并解决LC-MS/MS检测维生素的各种挑战和难点。该方法检出限低、分离效果好、稳定性佳，可满足临床高通量自动化检测需求。

图1. Andrew+移液机器人用于6种脂溶性维生素前处理操作时的工作台布局，以及ACQUITY UPLC I-Class Xevo TQ-XS IVD检测平台。

实验部分

 前处理

• 样本预处理：取100 μL 血清或者BSA稀释标准品，加入内标工作液，涡旋混匀，随后加入乙腈沉淀蛋白，离心取上清液，做SPE净化。

 液相色谱条件

• 液相色谱系统：ACQUITY UPLC I-Class系统
  

• 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱, 1.7 μm，2.1 mm x 50 mm

• 进样体积：5 μL

结果与讨论

 高通量，一针进样，同时检测

该方案5 min内即可完成6种脂溶性维生素的同时测定，可同时检测血清中维生素A(VA)、25-羟基维生素D2(25OHVD2)、25-羟基维生素D3(25OHVD3)、维生素E(VE)、维生素K1(VK1)、四烯甲萘醌K2(VK2-MK-4)，真正实现“一针进样，同时检测”。

图2. 6种脂溶性维生素的标准品和血清色谱图。

 灵敏度高，线性范围宽，满足临床检测需求

正常人体血清中维生素A含量113 - 977 ng/mL；维生素E含量3.8 - 17 μg/mL；维生素D含量20 - 50 ng/mL；维生素K1含量为0.10 - 2.20 ng/mL。由于6种脂溶性维生素在血清中含量差异较大，VK1、MK4和25OH-VD2含量低，同时测定高低浓度物质是串联质谱测定的难点，常存在低浓度、灵敏度差及高浓度过饱和现象。而Xevo TQ-S IVD和TQ-XS IVD优异的灵敏度及超宽线性范围，可实现同时准确定量这几种维生素。

自动化前处理，满足高通量检测需求

Andrew+机器人可在无人值守状态下自动完成移液、震荡、混匀和96孔板SPE前处理过程。不仅大幅节省了样品处理的时间，提高了通量，还可以简化样品制备过程、减少实验失误，从而确保分析结果的稳定重现。手动前处理96个样本的时间大概是2 - 3 h。如果用Andrew+做自动化前处理，只需要提前把溶剂和样本放到设置好的Domino blocks里中就可以完成自动化前处理和SPE流程。过程仅需不到1 h就可以完成。

结论

本方案使用Waters UPLC I-Class超高效液相色谱系统搭载UPLC色谱柱进行分离，再用Xevo TQ-S IVD和TQ-XS IVD串联四极杆质谱仪对血清样品中6种脂溶性维生素定量检测。96个样本的前处理不到1 h，每个样本的液相分析时间仅5 min，每天可以检测至少200例样本。6个脂溶性维生素的加标回收率85% - 115%之间，精密度RSD<8%，保证该方法检测样品的准确性和可靠性，可适用于临床高通量、自动化的样品检测。